蒙药珍宝丸促进脑缺血/再灌注大鼠血管新生作用及其含药血清对缺氧/复氧人脑微血管内皮细胞血管形成的影响

目的观察蒙药珍宝丸促进脑缺血/再灌注大鼠血管新生作用及其含药血清对缺氧/复氧人脑微血管内皮细胞(HBMEC)血管形成的影响。方法选取50只雄性Wistar大鼠,取40只随机分为假手术组、模型组、珍宝丸组及银杏叶组,各10只,模型组、珍宝丸组及银杏叶组制备脑缺血/再灌注模型,假手术组操作同脑缺血/再灌注模型,但线栓插入1 cm后即可拔出。珍宝丸组给予蒙药珍宝丸灌胃,银杏叶组给予银杏叶软胶囊灌胃,假手术组及模型组均给予相同体积生理盐水灌胃,2次/d,连续给药7 d。评估各组神经功能情况、脑梗死面积及微血管密度情况。取剩余10只大鼠,5只给予蒙药珍宝丸灌胃,5只给予银杏叶软胶囊灌胃,2次/d,均连续给药7 d后颈椎脱臼处死,分离含药血清备用。体外培养HBMEC,将对数期细胞分为正常培养组、缺氧/复氧组、珍宝丸含药血清5%、10%、20%组、银杏叶含药血清组,其中缺氧/复氧组、珍宝丸含药血清5%、10%、20%组及银杏叶含药血清组进行缺氧/复氧建模时,给予对应浓度血清进行培养;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组细胞活力;划痕实验检测各组细胞迁移能力;管腔形成实验观察内皮细胞血管形成能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞晚期氧化蛋白产物(AOPP)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量;Western印迹检测Toll样受体(TLR)4、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、蛋白激酶B(Akt)、p-Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p-mTOR、70 kD核糖体蛋白S6激酶(P70S6K)蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组神经功能评分升高,脑组织出现梗死灶,缺血区域新生血管数量增加,差异有统计学意义(均P<0.05);与模型组相比,珍宝丸组和银杏叶组神经功能评分显著降低,白色梗死灶面积均显著缩小,血区域新生血管明显增加(均P<0.05)。与正常培养组比较,缺氧/复氧组细胞活力明显降低,相对迁移距离明显缩短,细胞管腔节点数、网眼数、分支数明显减少,管腔长度明显缩短,细胞外液AOPP、MDA、IL-6、IL-1β、TNF-α含量明显升高,SOD含量明显降低,细胞中VEGF、HGF、TLR4、TRIF、p-Akt/Akt、p-mTOR/TOR及P70S6K表达均明显升高(均P<0.05);与缺氧/复氧组比较,珍宝丸含药血清5%、10%、20%组及银杏叶含药血清组细胞活力明显升高,相对迁移距离明显增加,细胞管腔节点数、网眼数、分支数明显增加,管腔长度明显增长,细胞外液AOPP、MDA、IL-6、IL-1β及TNF-α含量明显降低,SOD含量明显升高,细胞中VEGF、HGF、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR及P70S6K表达均明显升高,TLR4、TRIF表达均明显降低,且呈浓度依赖性(均P<0.05)。结论通过在体动物实验(脑缺血/再灌注)和体外细胞培养证实(缺氧/复氧),蒙药珍宝丸可通过TLR4/TRIF信号通路表达抑制氧化应激炎症反应,并激活Akt/mTOR/P70S6K信号通路促进血管形成,发挥神经保护作用。