利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

Development of real-time PCR assay for detection and quantitation of substance P mRNA in rats using SYBR Green Ⅰ

目的:建立检测大鼠P物质(SP)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段。方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增SP基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作标准品质粒;应用SYBR GreenⅠ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性。结果:标准品质粒构建成功,经酶切及测序鉴定,目的片段已插入pMD-18T载体;所建立的实时定量PCR方法的最低检测限度为104个拷贝/反应,在每反应104～109拷贝范围内,Ct值(荧光信号达到设定阈值所经历的循环数)与起始模板浓度具有良好的线性关系,r=0.998。结论:所建立的检测大鼠SPmRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点,适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测。