弓形虫主要表面抗原SAG1克隆、表达与纯化

扩增弓形虫RH株主要表面抗原SAG1基因编码序列,构建重组表达质粒,研究其在大肠杆菌中的表达,并予分离纯化.采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出编码截短的SAG1的编码序列,并克隆至pMD18-T载体上;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将序列正确的阳性克隆的插入片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌BL21,阳性克隆以PCR法与限制性酶切分析鉴定后,以IPTG进行诱导,对融合的表达产物经洗涤、变性、复性后利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析进行初步纯化.表达产物以SDS-PAGE和免疫印迹分析.PCR扩增出SAG1基因的特异片段,与预期片段大小相符,其TA阳性克隆的序列正确,所构建的重组体pGEX-4T-2/SAG1阳性克隆经双酶切和PCR鉴定与预期结果一致;诱导表达的融合蛋白经过复性纯化后,经SDS-pAGE和免疫印迹分析显示,SAG1基因在大肠杆菌中不仅有表达,且该重组抗原表达产物具有特异的免疫反应性.成功构建了弓形虫主要表面抗原SAG1的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中表达了SAG1的融合蛋白,纯化的蛋白具有良好的免疫原性.……