M6P/IGF2R11-15结构域介导了CREG对VSMC的生物学功能

目的本室前期研究提示M6P/IGF2R参与了CREG生物学效应的调控。本研究将着重阐明M6P/IGF2R各结构域在介导CREG对VSMC生物学功能中的作用,以及CREG蛋白分子中糖基化结构对其生物学效应的影响。方法 (1)构建真核表达载体,利用NTA-Ni柱亲和层析方法制备获得野生型wtCREG和去糖基化型mCREG蛋白,糖酐酶切和Western鉴定;(2)观察wt/mCREG蛋白对VSMC增殖、迁移、分化的影响;应用抗体阻断实验、免疫荧光双染色和免疫共沉淀法分析CREG蛋白是否与M6P/IGF2R直接结合;(3)构建原核表达载体,制备获得M6P/IGF2R结构域蛋白。Ellisa分析M6P/IGF2R各结构域与wt/mCREG的亲和力。应用竞争结合实验分析各结构域介导wt/mCREG蛋白生物学功能。结果 (1)wtCREG是糖基化蛋白,糖酐酶切后分子量由30KD变为25KD,而mCREG为去糖基化蛋白,糖酐酶切后分子量无变化,为25KD;(2)wt/mCREG蛋白均抑制VSMC迁移、增殖和分泌细胞外基质,促进其分化;wtCREG效应强于mCREG:wt/mCREG蛋白与M6P/IGF2R存在直接结合。(3)wtCREG蛋白与M6P/IGF2R7～10、11～15结构域具有高结合力,mCREG蛋白与11～15结构域存在高亲和力。wtCREG与第7～10结构域结合可以被M6P阻断。第11～15结构域片段阻断wtCREG和mCREG生物学效应,第7～10结构域仅阻断wtCREG蛋白的生物学效应。结论 CREG通过细胞膜表面M6P/IGF2R蛋白抑制VSMC的增殖、迁移、分泌细胞外基质,促进其分化。其作用与其分子中糖基化结构无关,糖基化可以增强CREG的生物学功能,M6P/IGF2R第11～15号结构域是CREG功能结构域。