X染色体连锁凋亡抑制蛋白的表达、纯化及多抗血清的制备

Prokaryotic expression,purification and antiserum preparation of X-linked inhibitor of apoptosis protein

目的:纯化原核表达载体表达的XIAP重组蛋白并制备多抗血清。方法:将重组蛋白原核表达载体Pet30a(+)/XIAP转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达。离心收集菌体后结合使用溶菌酶、冻融和超声破碎的方法裂解菌体,用含2 mol/L和4 mol/L尿素的结合缓冲液洗涤包涵体去除部分杂蛋白,随后用含8 mol/L尿素的结合缓冲液变性溶解剩余包涵体沉淀。用Ni-NTA柱通过亲和层析纯化重组蛋白且目的蛋白用含8 mol/L尿素的洗脱缓冲液洗脱,收集样品透析复性。以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用ELISA方法检测抗血清的效价。结果:成功构建人XIAP重组蛋白原核表达载体且目的蛋白以包涵体形式表达,分子量约54 kD,与预期的一致,经包涵体洗涤、变性溶解,亲和层析及分步透析复性获得纯度达90%以上的重组蛋白,ELISA结果显示其抗血清的效价为1∶50 000。结论:成功构建人XIAP表达载体以及纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多抗血清,为进一步研究XIAP的功能、研制诊断试剂奠定了基础。