甘薯β—淀粉酶cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达

用RT-PCR技术从甘薯新大紫(Ipornoea batatas Lam cv．Xindazi)块根总RNA中扩增出预期大小的DNA片段(约1．5kb)。将该片段克隆至pMD—T载体，经酶切分析和序列测定后，正向插入的重组子命名为pMD—cAmy，插入片段长1521bp，编码499个氨基酸残基的多肽，分子量55998kD。克隆的β—淀粉酶cDNA与报道的甘薯另一品种Kokei No．14的mRNA有99％的序列相同，与Calystegia sepiumβ—淀粉酶mRNA有87％相同。重组子pMD—cAmy经IPTG诱导后，胞内可溶性提取物经凝胶电泳和活性染色，出现明显的淀粉酶活性带。SDS—PAGE表明，大肠杆菌表达的β-淀粉酶亚基的分子量约为50kD。重组子pMD—cAmy在淀粉平板上形成明显的水解圈，说明甘薯β-淀粉酶cDNA不仅能在大肠杆菌表达，而且能将有活性的β-淀粉酶分泌到胞外。对重组子pMD—cAmy和甘薯块根可溶性提取物的比较发现，大肠杆菌表达的β-淀粉酶与甘薯块根的β-淀粉酶除迁移率不同外，对淀粉酶活性抑制剂EDTA和β-巯基乙醇的敏感性相同。