一种构建 cDNA 文库时 Sepharose CL-4B 筛分 cDNA 的简化方法

构建 cDNA 文库时,为了提高获得全长 cDNA 的可能性,在进行连接和包装反应之前,应当采用Sepharose CL-4B 柱层析对 cDNA 首先进行筛分。一般的方法是在提取 mRNA 之后,利用逆转录酶合成cDNA 第一链,然后直接在第一链反应混合液中加入同位素、RNase H 和 E.coli DNA 聚合酶 I 示踪合成cDNA 第二链,再进行甲基化、连接接头并以限制性内切酶消化,上 Sepharose CL-4B 柱层析进行分离。显然这一程序由于多次使用同位素,增加了放射污染材料扩散的可能,也给整个实验过程带来不便。