单引物连接法对未知 DNA 序列的 PCR 扩增

有文章报道:将未知序列的待扩 DNA 经限制性内切酶消化,产生3′端突出的粘末端,再设计一 PCR(聚合酶链反应)引物,其3′端含有与该酶切口互补的序列,以引物作接头,用 Taq 连接酶直接将其连到待扩片段的粘端上,PCR 扩增成功。但我们试验中所用T4DNA 连接酶不能连接靠近单链区域的缺口,因而需在此设计基础上做些改进(图1):将接头(即 PCR 引物)与内切酶 Nsp I 切出的 DNA 粘端复性,用 Klenow酶填平复性后的末端,使之成为双链,这样,连接酶就可把接头与 DNA 片段间的缺口连好,末端填平时合成了与引物5′端互补的序列,这段序列正好是 PCR 反应中模板与引物的复性位置。目前已在λDNA