巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

Molecular cloning and procaryotic expression of macrophage migration inh ibitory factor gene

目的:扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因,并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法:根据人MIF基因序列,设计、合成PCR引物,利用RT -PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX - 4T - 1,并将构建正确的重组表达载体pGEX - 4T -MIF转化工程菌BL2 1(DE3) ,用异丙基硫代- β-D -半乳糖(IPTG)诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF ,行柱上凝血酶消化,洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验(MMI)鉴定MIF蛋白的生物活性。结果:限制性内切酶分析和DNA测序结果表明,成功构建了重组质粒pGEX - 4T -MIF ,人MIFcDNA长348bp ,编码115个氨基酸。经IPTG诱导,高效表达出可溶的GST -MIF蛋白。SDS -PAGE和Westernblotting分析显示,GST -MIF经凝血酶消化,获得13kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30 % ,具有生物活性。结论:克隆、测定了人MIF基因,在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。