PCR技术中标本的处理方法及改进

自Saiki等于1985年首次报道聚合酶链反应(PCR)以来,PCR已对生物学研究的许多领域产生了深刻的影响。并被广泛应用。PCR操作的成败受诸多因素的影响,包括样品的处理和模板的制备,引物的选择,缓冲液的组成,温度程序等。其中最棘手的步骤之一就是样品的处理。因处理方法的选择决定着分离DNA的质量与PCR的成败。而提高模板DNA质量的关键,是避免和去除抑制因子和提高模板DNA的产量,其中以前者更为重要。通过近年来诸多学者的实践,现已有了一些常规的方法和改良的措施,并收到了良好的效果。本文就此问题进行探讨。 常规的样品处理法 一、酚—氯仿提取法 样品血清,尿不用处理,经处理后,加裂解液(20mM Tris.clpH8.6,100mMEDTA,0.1％SDS或0.5％非离子去污剂NP-40与Tween-20,100～200μg/ml蛋白酶K)混匀,56℃～60℃ 1～4h,等体积酚-氯仿-异戊醇抽提,无水乙醇沉淀,TE溶解。此法蛋白质去除彻底,Taq酶活性不受干扰,具有良好的重复性与稳定性,但其操作繁琐,灵敏性降低,在临床诊断方面有其局限性。