犬冠状病毒分子生物学研究 犬冠状病毒纤突蛋白基因的初步研究

本研究根据 Wesseling 发表的犬冠状病毒(CCV)K378株纤突蛋白(S)基因序列,设计合成了4条寡聚核苷酸引物 P1(18bp,1520—1537bp)、P2(19bp,2072—2090bp)和 P3(20bp,2621—2640bp)、P4(20bp,2944—2963bp)。以 P1、P2、和 P3、P4为引物,以美国 CCV NL—18株反转录产物为模板,建立了 CCV RT—PCR 方法,并将其中纯化的 P3和 P4PCR 产物标记 a—^(32)P同位素,制备了 CCV 特异核酸探针。以正常CRFK 细胞和 CCV NL—18株反转录产物为阴、阳对照,通过对犬瘟热、狂犬病、犬副流感、犬传染性肝炎和犬细小病毒5种对照病毒细胞培养物检测发现,分别以 P1、P2和P3、P4为引物,只有 CCV NL—18株 RT—PCR 产物在电泳凝胶上可见到大小为57bp和343bp 的核酸片断,与设计大小相同,正常细胞和对照病毒 RT—PCR 产物无核酸带出现;核酸探针检测结果,只有 CCV NL—18株呈阳性,正常细胞和对照病毒均为阴性。RT—PCR 和核酸探针对 CCV NL—18株反转录产物的检出敏感度分别为10^(-4)和10^(-3)/ul。以 P1、P2为引物对本室最近分离到的CCV—CS1、CCV—HH1、CCV—CI1和CCV—YI1四株病毒的第7代 CRFK 细胞培养物进行 RT—PCR 扩增,2%琼脂糖电泳,均获得571bp 的核酸片段。继而经 PVUⅡ酶切试验,CCV NL—18株和 CCV—CS1等四株病毒的 RT—PCR 产物均可切成418和153bp 两条核酸片段,与具有 PVU Ⅱ酶切位点的 CCV 强毒 K378株相同,而不同于无此酶切位点的 CCV 弱毒 Insavc—1株。用 CCV—CS1等四株病毒反转录产物与核酸探针杂交,结果均为阳性。上述结果证明,这四株病毒均为 CCV,而且在易变的 S 基因的1520—2090bp 之间无基因缺失和插入现象。通过本研究,不仅为 CCV 感染建立了敏感、特异的诊断方法;而且通过对国内首次分离获得的 CCV—CS1等四株 CCV 进行了初步研究,同时也为正在进行的 CCV S 基因的克隆、测序和表达研究奠定了基础。