Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定

Construction,expression and purfication of prokaryotic expression plasmid of Flt3 ligand gene and identification of its biological activity

目的:获得人Flt3配体(FL)cDNA胞外段序列,构建表达人FL蛋白的原核重组表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定目的蛋白。方法:提取K562细胞总RNA,利用巢式PCR技术扩增出目的cDNA序列,构建重组质粒pGEM-FL,经酶切、PCR和测序鉴定后,将rhFL基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-rhFL,在大肠杆菌M15中诱导表达。用镍凝胶亲和层析方法纯化目的蛋白,Westren blotting杂交鉴定纯化蛋白,并用造血集落形成实验检测生物学活性。结果:经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的FL基因序列100%一致。构建的原核表达载体PQE30-rhFL在大肠杆菌M15中经1 mmol.L-1IPTG诱导后表达出相对分子质量为25000的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Westren blotting,在相对分子质量为25000处可见特异性着色带。结论:构建了原核表达载体PQE30-rhFL,并成功诱导了rhFL蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的rhFL蛋白。