人Cyclin E原核表达载体的构建及表达

目的:构建人CyclinE基因原核表达载体,并在E.coliBL21中表达并纯化。方法:PCR扩增人CyclinE基因片段,并将其克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a(+)-CyclinE。经限制性内切酶EcoRI与XhoI双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21,经IPTG诱导表达组氨酸融合蛋白。结果:获得全长约为1200bp的人的CyclinE基因片段。以构建的重组质粒pET32a(+)-CyclinE转化E.coliBL21后,经IPTG诱导,表达出相对分子质量(Mr)约60000的融合蛋白。经SDS-PAGE、Westernblot分析显示,诱导表达的蛋白为CyclinE。结论:成功地构建了表达载体pET32a(+)-CyclinE,并表达出重组蛋白His-CyclinE,为进一步筛选在体内外能与CyclinE和CDK2结合的新蛋白奠定了基础。