苯并(a)芘诱导BEAS-2B细胞恶性转化的不同阶段特征

目的分析致癌物作用后至细胞转化过程中不同代次细胞的表达变化特征,为寻找出可能发生癌变的关键阶段、揭示致癌机制提供科学依据。方法采用永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B,分设B(a)P组和DMSO溶剂对照组,染毒时间24h后细胞常规培养,系统观察发生于转化过程中的细胞生物学特性并由血清抗性、锚着独立性生长能力,裸鼠成瘤试验来鉴定细胞的恶性转化情况,建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B恶性转化不同代次的细胞模型。采用细胞遗传学方法分析了不同代次细胞的染色体改变;提取实验组和对照组不同代数细胞的mRNA,用Affymetrix公司U133plus2.0人类全基因组表达谱芯片分析获得差异表达基因,并对差异表达的基因进行筛选。结果实验组细胞在20代后细胞形态不规则的数量开始增多,核浆比例增大,出现病理性核分裂像。第10代时各组细胞血清抗性试验均为阴性;第20代实验组细胞出现血清抗性和倍增时间增长。25代时实验组细胞在软琼脂上可形成小的细胞集落,细胞数十个左右聚集成团,但生长缓慢,不能进一步形成较大的克隆,达不到每个集落大于50个细胞的标准;至第30代时,实验组细胞即能在软琼脂上形成克隆。软琼脂克隆形成细胞经体外扩增培养后生长紊乱,极性消失,可见重叠生长。中途死亡实验组裸鼠两只,常规病理切片检查,有异形上皮细胞聚集成团,已具备癌前转化的特征。从第20代出现染色体核型异常,主要类型有多倍体、染色体断裂、双着丝粒等。得到第1、5、10、20和30代实验组与对照组细胞不同代次细胞表达的基因谱。发现不同代次细胞表达的基因谱有明显不同的特征,且各代之间差异表达的基因也有很大差异,以1、5和30代细胞表达的差异基因为基准对差异基因进行了聚类分析,初步揭示了这些差异基因在不同代次细胞的表达模式和特征。结论从已知的与肿瘤相关的基因变化来看,尽管第5代已有肿瘤相关基因的变化,但以10、20代细胞的变化最明显,提示此阶段可能是癌变的关键阶段,而第10代可能是细胞癌变的早期阶段。