HSV-1的microRNA-LAT基因修饰人骨髓间充质干细胞的体外研究

人骨髓间充质干细胞(HMSCs)具有强大的多向分化潜能,能为组织移植和体外基因传递载体.单纯疱疹病毒1型(HSV-1)不仅具有嗜神经元性,而且对HMSCs也具有很强亲嗜性,可作为HMSCs的基因修饰载体,主要通过其自身携带的microRNA-LAT发挥抑制凋亡作用.本研究构建针对microRNA-LAT的特异性茎环结构的逆转录引物,并用特殊探针的real-time RT-PCR方法检测HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT的相对定量水平.采用顺铂诱导对照法观察HSV-1对HMSCs的作用.通过观察HMSCs细胞形态和流式细胞仪检测细胞凋亡率,评测HSV-1引起的HMSCs抗凋亡功能;同时采用RNAi方法,化学合成TGF-β信号传导通路中SMAD3及TGF-β1靶点的siRNA和microRNA-LAT siRNA.从基因mRNA,microRNA和蛋白质水平,分别采用RT-PCR,real-time RT-PCR和Western blotting方法,检测HMSCs中microRNA-LAT和SMAD3及TGF-β1表达水平及其相互关系.结果表明,与单纯顺铂诱导对照组相比,HSV-1组和microRNA-LAT组HMSCs凋亡细胞数减少,细胞凋亡率降低(P<0.05),具有抗凋亡作用;在TGF-β信号传导通路中,HSV-1组和microRNA-LAT组TGF-β1与SMAD3靶点基因在mRNA水平及蛋白水平的表达量均观察到一定程度降低,且降低水平与采用RNAi法的SMAD3组和TGF-β1组相类似.Real-time RT-PCR结果显示,与空白对照组相比,顺铂组HMSCs细胞质中成熟microRNA-LAT mRNA水平有所降低(P<0.05).据此,HSV-1及其microRNA-LAT可敲除SMAD3和TGF-β1基因,下调TGF-β信号传导通路表达而对顺铂诱导的HMSCs凋亡有拮抗作用.本研究结果证明,HSV-1自身携带的microRNA-LAT对HMSCs细胞TGF-β信号传导通路中的SMAD3和TGF-β1具有精细调节和基因修饰作用,使HMSCs具有抗凋亡功能,并且HSV-1可作为针对HMSCs的特殊基因修饰候选载体.