力达霉素抗人大细胞肺癌的分子机制研究

目的研究抗肿瘤抗生素力达霉素(LDM)对于人大细胞肺癌H460细胞增殖、细胞周期与凋亡、侵袭转移、血管生成等的影响并探讨其分子作用机制,并通过体内H460裸鼠移植瘤实验,观察LDM体内抗瘤作用。方法体外实验:采用MTT法观察LDM对细胞增殖的抑制作用;利用Hoechst33342荧光染色、固定细胞PI单染、活细胞AnnexinV-FITC/PI双染法及TUNEL法检测LDM对细胞凋亡及周期的影响;采用West- ern blot法检测LDM对增殖相关信号通路蛋白、细胞周期及凋亡相关蛋白表达的影响;通过明胶酶谱法、Transwell实验检测LDM对细胞侵袭和迁移的影响;体内实验:H460细胞接种于无胸腺裸鼠,比较吉非替尼与LDM对于肿瘤增殖的抑制作用。结果LDM能够明显抑制人大细胞肺癌H460细胞的增殖,其IC_(50)值为3.65×10^(-12)±2.94×10^(-12)M,比常用抗肿瘤药物丝裂霉素、紫杉醇、阿霉素、长春新碱、5氟尿嘧啶、顺铂、吉西他滨对H460的IC_(50)值低10~4～10~8倍。不同浓度LDM作用细胞48h后,细胞凋亡比例逐渐增高,0.5nM、1nM、2nM LDM的早期凋亡诱导率分别为43.30±4.26%、46.54±2.40%、69.87±3.29%;0.1nM、0.5nM的LDM可引起G2/M期阻滞,2nM可引起S期阻滞。Hoechst33342荧光染色及TUNEL法检测也验证了LDM的剂量依赖的凋亡诱导作用。Transwell实验结果显示,LDM有显著地抑制细胞迁移和侵袭的作用。明胶酶谱法结果显示LDM可显著抑制MMP-2的活化及MMP-9的分泌,进一步证实了LDM的抗侵袭转移的能力。Western bloting法结果显示LDM可下调H460细胞p-EGFR、p-HER2、p-AKT、p-JNK的水平,对p-P38无明显影响,对p-ERK则是剂量依赖的上调作用。LDM还可通过减少EGF、VEGF、COX-2、EGFR,、KDR、NF-κB、MMP-9、MMP-2、K-RAS等的分泌和表达达到抑制细胞增殖、抗血管生成及侵袭转移的作用;LDM通过上调P53、P21蛋白的表达,下调CyclinB1、p-RB、Bcl-2的水平,增强PARP切割片段、激活caspase-3,caspase-7蛋白酶活性等起到诱导凋亡和周期阻滞作用。此外,LDM能够明显抑制H460裸鼠移植瘤的生长,其中0.025mg/kg及0.05 mg/ kg LDM剂量组的抑瘤率分别为52.7%和72.7%,与对照组相比有显著性差异。50 mg/kg的吉非替尼的抑瘤率为69.1%,与0.05 mg/kg LDM组抑制作用接近。结论烯二炔类抗生素LDM通过抑制人大细胞肺癌多条信号通路靶点蛋白的表达及活化而发挥抗增殖、诱导凋亡、周期阻滞、抑制血管生成、抗侵袭转移的作用,并能显著抑制大细胞肺癌裸鼠移植瘤的生长,大剂量下与肺癌靶向药物吉非替尼的抑制作用相当。