人肾小球系膜细胞纤溶酶原激活物抑制物cDNA克隆和高效表达

利用逆转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)方法 ,从中国正常人肾小球系膜细胞总RNA中扩增出人纤溶酶原激活物抑制物 (PAI 1 )基因cDNA编码区序列 ,并定向亚克隆至pUC1 9质粒 ,克隆的PAI 1cDNA去除了信号肽核苷酸序列并加入新的起始密码ATG ,编码区序列与文献报道的人内皮细胞PAI 1cDNA序列完全相同 .将PAI 1cDNA定向亚克隆至原核表达质粒 pBV2 2 0 ,构建了重组PAI 1基因表达质粒pBV2 2 0 PAI 1 ,在大肠杆菌中得到了高效表达 ,重组PAI 1蛋白表达占菌体总蛋白 45 % .Westernblotting检测 ,在分子量约为 43.0ku处出现一特异性蛋白质条带 .对形成包涵体的表达产物进行变复性处理及FPLC纯化 ,获得纯度 97%以上的潜伏态重组PAI 1 .经 4mol/L盐酸胍激活后 ,重组PAI 1具有与天然PAI 1同样的生物学活性 ,对尿激酶型纤溶酶原激活物 (u PA)具有显著抑制活性 .