抑癌基因PTEN shRNA腺病毒载体的构建

目的:构建抑癌基因PTENshRNA腺病毒载体,探讨PTEN在哮喘患者气道重塑的作用机制。方法:设计形成短发夹序列(shRNA)的PTEN-shRNA引物对应的模板DNA序列,亚克隆至pShuttle-GFP-U6重组穿梭载体,构建穿梭质粒pShuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA。鉴定正确后,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,得到pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA病毒质粒,将pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒经PacI线性化后转染HEK293细胞,包装重组、并大量扩增pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA腺病毒质粒,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度,Western blot检测PTEN蛋白水平的表达。结果:结果证实pShuttle-GFP-U6-PTEN-shRNA及pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA质粒构建正确,收获病毒后的PCR及Western blot检测结果均证明pAdxsi-GFP-U6-PTEN-shRNA包被成功。结论:抑癌基因PTENshRNA腺病毒载体成功构建,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了相关的实验基础。