T淋巴细胞活化相关的microRNA的筛选、靶分子的预测、构建和鉴定

目的:筛选T细胞活化相关的microRNA并预测其靶分子,通过双荧光素酶实验鉴定这些microRNA的靶分子。方法:利用ExiqonmiRNA基因表达谱芯片,以活化的Jurkat细胞(用CD3抗体和CD28抗体双信号活化)为实验组,未活化Jurkat细胞为对照组,分析了二者miRNA表达谱的差异,找出表达水平显著改变的miRNA,并通过实时定量PCR的方法对芯片结果进行验证;构建miRNA的真核表达载体;利用生物信息学方法预测miRNA的靶分子,构建含靶分子3′UTR的荧光素酶报告基因质粒;分别将miRNA基因真核表达质粒与含有靶分子的荧光素酶报告基因质粒共转染HEK293细胞,进行荧光素酶实验来鉴定miRNA的靶分子。结果:ExiqonmiRNA基因表达谱芯片显示:Jurkat细胞活化后,miR-202*、miR-33b、miR-568和miR-576的表达明显下调;实时定量PCR验证结果与芯片结果一致;酶切鉴定与序列测定证实miR-568的真核表达载体构建成功;利用miRanda软件预测miR-568的靶分子,筛选出与T细胞活化密切相关的分子;双荧光素酶实验显示miR-568对NFAT5有比较明显的抑制作用。结论:T细胞活化后,miR-202*、miR-33b、miR-568和miR-576表达明显下调;NFAT5可能是miR-568作用的一个靶分子。