结直肠癌相关抗原的纯化及分析

<正>肿瘤细胞相关抗原对肿瘤临床诊断及预后监测具有重要意义.近年来应用单克隆抗体技术,鉴定出许多肿瘤相关抗原.目前在临床上应用的结直肠癌标志物除CEA外,还有CA19-9、结直肠癌相关抗原(CCA)等.本文采用鼠抗人结直肠癌单克隆抗体纯化结肠癌组织中的CCA,并对此抗原作初步分析.1 材料与方法1.1 可溶性抗原的制备 人结肠癌组织用生理盐水洗净.将肿瘤组织剪成小块,加入0.01mol/LpH7.2(含3mol/L氯化钾)磷酸缓冲液,制成匀浆.4℃搅拌14h.10000r/min离心30min,上清液用上述缓冲液透析48h.将此提取液边搅拌边滴加3mol/L 高氯酸,至其最终浓度成0.6mol/L,4℃搅拌30min,10000r/min离心30min,上清液透析,稍作浓缩.测定蛋白浓度为2.5×10~2mg/ml.1.2 单抗亲和层析柱的制备和亲和纯化CCA将抗CCA单克隆抗体腹水(IgGl,中国科学院细胞生物研究所提供)经二次盐析后,用pH8.3 0.1mol/L 碳酸缓冲液透析平衡.每毫升 CNBr活化Sepharose 4B凝胶加20mg抗体蛋白混合.室温倒转反应2h,继用1mol/L.pH7乙醇胺封闭2h,制成单抗亲和层析柱.最后用0.15mol/L pH7.2磷酸缓冲液平衡,装柱.将上述高氨酸提取液上亲和层析柱.解高用0.2mol/L pH2.5甘氨酸-HCI缓冲液,收集并及时中和所得抗原蛋白液.1.3 免疫酶法测定