葡萄糖激酶基因E339K突变的功能学研究

The functional analysis of glucokinase gene E339K mutation

目的 探讨葡萄糖激酶（GCK）基因E339K突变引起青少年的成年起病型糖尿病2型（MODY2）的分子机制.方法 MODY2家系成员进行葡萄糖耐量试验,测定空腹及负荷后2h血糖、糖化血红蛋白、空腹胰岛素.PCR扩增GCK基因并直接测序.构建E339K突变质粒.表达并纯化野生型和突变型GCK蛋白.酶偶联分析法进行功能学测定.结果 与非突变成员相比,突变者空腹、负荷后2 h血糖、糖化血红蛋白更高;空腹胰岛素、胰岛素分泌指数明显降低;胰岛素抵抗指数无显著差异.突变导致GCK蛋白产量降低[（12.7±1.72）mg/L比（16.2±2.65）mg/L,P＜0.01];当ATP为饱和浓度时酶促反应速度达到1/2最大反应速度时的葡萄糖浓度（S0.5）[（13.96±1.89）mmol/L比（5.92±0.99）mmol/L,P＜0.001]和当葡萄糖为饱和浓度时酶促反应速度达到1/2最大反应速度时的ATP浓度（ATP-Km）显著升高[（3.27±1.14）mmol/L比（0.30±0.09）mmol/L,P＜0.001];GCK对葡萄糖的催化常数显著下降[（1.62±0.35）/s比（25.18±2.10）/s,P＜0.001];热稳定性下降,表现为在相对更低的孵育温度下或同一温度相对更短的时间内活性丧失.结论 GCK基因E339K突变导致的蛋白表达下降、对葡萄糖和ATP的亲和力下降以及热稳定性下降是造成胰岛β细胞分泌胰岛素减少进而发生MODY2的可能分子机制.

Objective To explore the molecular mechanisms of glucokinase （GCK） E339K mutation resulting in maturity-onset diabetes of the young-2 （MODY2）.Methods Fasting plasma glucose （FPG）, oral glucose tolerance test （OGTT） overload 2 h glucose （2hPG）, glycosylated hemoglobin Alc （HbAlc） and fasting insulin （FIns） level were measured, respectively.Mutant glutathione S-transferase （GST）-GCK-cDNA was constructed with site-directed mutagenesis.Wild type and mutant GCK protein expressed in E.Coli were purified with affinity chromatography.Enzymatic kinetics and thermal stability were tested with enzyme-coupled analysis.Results Compared with non-mutants, mutants had higher FPG [（6.92 ± 0.95） mmol/L vs （4.70 ± 0.35） mmol/L, P〈0.001], 2hPG [（9.00 ± 1.49 ） mmol/L vs （5.51 ± 0.86） mmol/L,P〈0.001],HbAlc[（6.46 ± 0.69）% vs（4.83 ± 0.30）%,P〈0.01],and lower FIns level [（6.15 ± 1.97 ） mIU/L vs （ 10.79 ± 4.93 ） mIU/L, P 〈 0.01], HOMA-β （34.16 ±3.62 vs 172.53 ± 76.58, P 〈 0.001 ）.This mutation induced lower protein yield [（ 12.7 ±1.72） mg/L vs （ 16.2 ± 2.65 ） mg/L, P 〈 0.01], lower appetency for glucose [S0.5： （ 13.96 ± 1.89）mmol/L vs （5.92±0.99）mmol/L, P〈0.001] and ATP [Km：（3.27 ±1.14） mmol/L vs （0.30±0.09）mmol/L, P〈0.001], lower catalytic ability [Kcat：（1.62 ±0.35）/s vs （25.18 ±2.10）/s, P〈0.001].It also showed protein thermal instability.Conclusion Glucokinase gene E339K mutation promotes the development of MODY2 by affecting protein yield and protein stability as well as the enzymatic kinetics of GCK.