人PML-Ⅲ基因多克隆抗体制备及鉴定

目的:构建人PML-Ⅲ基因的原核表达载体,制备人PML-Ⅲ多克隆抗体,并用该抗体观察PML核体的亚细胞结构定位以及PML蛋白的SUMO-1修饰。方法:从质粒pEG-FP-PML-Ⅲ中PCR扩增得到人PML-Ⅲ(1-600 bp)基因并克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中,诱导表达后经亲和层析纯化获得融合蛋白GST-PML-Ⅲ,以该蛋白作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体。分别通过ELISA、免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体效价和特异性。脂质体包埋法将PML-III和SU-MO-1的真核质粒转染到HeLa细胞,用免疫荧光和Westernblot方法分别检测PML核体的亚细胞结构定位以及PML蛋白的SUMO-1修饰。结果:成功构建PML-Ⅲ的原核表达载体,并获得多克隆抗体;经ELISA、免疫荧光和Western blot检测,证实所制备的PML-Ⅲ多克隆抗体具有较高的特异性,并且效价为1∶128 000;研究结果还表明PML核体定位于细胞核,并且该抗体可以检测到PML蛋白的SUMO-1修饰。结论:获得了较高特异性的人PML多克隆抗体,为进一步研究PML核体形成和降解的机理以及在这个过程中重要蛋白之间的相互作用打下基础。