禽源细胞中miRNA表达方法建立及基因沉默效率检测

从Genscript软件预测的10个GFP报告基因序列特异性miRNA中随机选择1个,通过PCR法合成相应双链寡核苷酸,插入含鸡U6启动子的pRFPRNAiC载体,获得pRFPRNAiGFP;将pRFPRNAiGFP与peGFP-N1共转染COS-1、293-T、CEL和CEF细胞,在RT-PCR法确定miRNA表达后,根据转染细胞中GFP阳性细胞数及荧光强度变化,比较鸡U6启动子在哺乳动物源和禽源细胞中介导的miRNA沉默效率。结果显示,pRFPRNAiGFP在哺乳动物和禽源细胞中都能表达抑制性miRNA,但在禽源细胞中的基因沉默效率较高。因此,pRFPRNAiC可作为禽源细胞中表达miRNA的载体,GFP则是检测沉默效率的很好的报告基因,本研究为在禽源细胞中进行RNAi研究创建了平台。