起搏基因质粒的构建及体外转染心肌细胞的研究

目的:构建重组起搏基因质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并检测其在体外心房肌细胞中的表达,探讨其构建生物起搏器的可行性。方法:对含mHCN2 cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得mHCN2基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,进行双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒用电穿孔法转染心房肌细胞,通过免疫荧光及RT-PCR检测重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2在体外心房肌细胞中的表达情况。而对照组仅转染pIRES2-EGFP。结果:构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染起搏基因后的心房肌细胞呈绿色荧光,其搏动频率较未转染的细胞及对照组明显增快(180±11次/分vs140±14次/分vs143±12次/分,P<0.05)。实验组RT-PCR及免疫荧光显示了mHCN2 mRNA基因及蛋白的表达,而对照组未见到该基因片段及其荧光表达。结论:成功地构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并在体外心房肌细胞中成功表达,为生物起搏的研究奠定基础。