人 FN cDNA 重组逆转录病毒载体及高表达 FN 肿瘤细胞株的构建

目的：探讨 Ｆ Ｎ 对肿瘤细胞生物学行为的影响，将人 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 基因导入低表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｊ中，构建高表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株２５３ Ｆ Ｎ。方法：通过 Ｄ Ｎ Ａ 重组技术，将人全长 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段插入到逆转录病毒载体ｐ Ｌ Ｊ中，经 Ｐ Ａ３１７细胞包装，生产出４代病毒液，感染 Ｎ Ｉ Ｈ３ Ｔ３细胞后，测得假病毒滴度。用高滴度病毒液感染２５３ Ｊ细胞，经４００ μｇ／ｍ ｌ Ｇ４１８筛选，产生抗性克隆。继续传代培养，一步法提取细胞总 Ｒ Ｎ Ａ，进行 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 印迹杂交。结果：２５３ Ｆ Ｎ 细胞除７６ ｋｂ 处显示微弱的内源杂交带以外，在９６ ｋｂ 处有一条较强的杂交带；免疫组化结果显示２５３ Ｆ Ｎ 细胞的胞浆及胞膜均为棕红着色，而２５３ Ｊ细胞和空载体转染细胞仅轻微着色。结论：转染后的细胞染色体中成功地整合了 Ｆ Ｎ ｃ Ｄ Ｎ Ａ 片段，并能够在转录水平和蛋白水平表达。从而建立了高表达 Ｆ Ｎ 的肿瘤细胞株，为深入研究肿瘤的转移机理奠定了基础。