miR34a通过调控乙醛脱氢酶2参与心肌细胞凋亡及心室重构

背景和目的乙醛脱氢酶2(ALDH2)是一种内源性心肌保护因子,通过代谢4-HNE等毒性醛类在心肌梗死过程中起抗心肌细胞凋亡并改善心室重构作用。miRNA在很多生物的生理和病理过程中发挥重要作用,影响细胞凋亡、增殖,并与许多疾病相关。我们前期研究发现,ALDH2在心肌缺氧早期呈显著下降趋势。本研究拟从microRNA角度探讨ALDH2下降的机制,并探索内源性抑制ALDH2下降的作用靶点。方法利用实时定量PCR研究缺氧心肌细胞中miR34a及ALDH2 mRNA的表达情况,同时利用Western blot检测ALDH2蛋白表达,以观察miR34a与ALDH2在缺氧心肌细胞中变化趋势是否相关。在此基础上,利用microRNA特异模拟及抑制技术调控miR34a的表达,同时利用siRNA及高表达病毒转染技术调控ALDH2表达,观察miR34a与ALDH2的改变是否都能够改变心肌细胞缺氧后凋亡的反应情况。进一步利用miR34a特异模拟剂和抑制剂分别上调和下调microRNA的表达后,检测心肌细胞内ALDH2表达变化,以证实miR34a可以抑制ALDH2的翻译表达。进而,我们将采用荧光报告基因质粒技术,构建GFP后带有ALDH2 3’UTR的报告质粒,同时与miR34a模拟剂共转染至HEK293细胞后观察GFP荧光亮度,从而得到miR34a与ALDH2 3’UTR结合的直接证据。结果在心肌细胞缺氧早期(48 h以内),我们发现ALDH2蛋白水平于6 h开始下降而其mRNA水平于48 h才出现显著降低,表明ALDH2蛋白在缺氧早期的下降并不是由转录水平调控引起的,提示可能存在转录后水平调节。接下来我们对缺氧状态下miR34a变化趋势进行观察,发现miR-NA34a于2 h上升至对照组10倍左右,直至4 h仍保持在4倍左右水平(P<0.05),提示其可能参与心肌细胞缺氧的早期调节。ALDH2与miR34a之间是否存在联系?ALDH2的下降是否由miR34a引起?为证实以上猜想,我们利用miR34a模拟剂转染心肌细胞,上调其表达后Western blot检测发现ALDH2蛋白表达水平下降,同时利用miR34a抑制剂下调其表达后发现ALDH2上升,这样我们从正反两方面同时证明miR34a能够调控ALDH2蛋白表达。前期实验已证实上调ALDH2具有抗凋亡作用而下调则加重凋亡。为探讨miR34a与ALDH2在功能上的相关性,我们对心肌细胞转染其模拟或抑制剂,给予缺氧24 h处理,诱发凋亡后进行TUNEL检测,发现miR34a高表达组凋亡水平较高而低表达组则凋亡较轻,从功能上证实miR34a与ALDH2关系符合预期。结论心肌细胞缺血缺氧早期ALDH2的下降是由miR34a对其翻译过程的抑制引起。阻滞miR34a对ALDH2的抑制,可能成为早期发挥ALDH2心肌保护作用的关键节点。