TIMP-2基因过表达抑制成釉细胞瘤侵袭性生长的实验研究

目的探讨基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)基因转染体外培养的人成釉细胞瘤(AM)细胞侵袭性生物学行为的改变,进一步研究MMP-2、TIMP-2与AM局部侵袭性的关系。方法 pcDNA3.1(+)/GFP-TIMP-2质粒转染人AM细胞。空白对照组:不加任何处理因素;脂质体对照组:加入4μL Lipo-fectamine 2000和250μL Opti-MEMⅠ混合物;转染阴性载体对照组(P0):转染2μg阴性对照质粒pcDNA3.1(+)/GFP;实验组:分别转染不同浓度的质粒pcDNA3.1(+)/GFP-TIMPI 1μg(P1)、2μg(P2)、3μg(P3)。倒置相差荧光显微镜观察转染情况,流式细胞仪测定转染效率。明胶酶谱法检测基质蛋白酶-2(MMP-2)的活性。逆向明胶酶谱法检测TIMP-2的活性。RT-PCR分析MMP-2以及TIMP-2 mRNA的表达。Western blot分析MMP-2及TIMP-2蛋白的表达情况。三维培养观察分析细胞生长状况。Transwell微侵袭分析。结果与空白对照组比较,不同浓度质粒转染组的MMP-2均有不同程度的抑制,差异有显著性(P<0.05);72 h MMP-2抑制率为54.38%。TIMP-2的活性均有不同程度的增加,差异有统计学意义(P<0.05);72 h的TIMP-2增加率为43.75%。MMP-2蛋白表达水平P2明显低于P1、P3组,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,转染72 h后,不同质粒组的MMP-2蛋白表达水平的抑制率分别为16.1%、45.3%及39.6%。不同浓度组的TIMP-2蛋白表达水平的增加率分别为26.1%、61.3%及32.6%。在Transwell中培养72 h后,各对照组之间细胞的细胞计数差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,质粒转染组Transwell下室细胞的细胞数明显减少(P<0.05)。两组的相对侵袭抑制率分别为53.7%及46.9%。结论 TIMP-2基因转染AM细胞后,TIMP-2的mR-NA及蛋白表达增加,蛋白活性亦增加;MMP-2 mRNA表达量无明显改变,其蛋白表达量及活性降低。细胞的侵袭性被部分抑制,可能机制是TIMP-2基因过表达使MMP-2活性降低所致。TIMP-2及MMP-2以及两者的关系可能是影响AM局部侵袭性生长的原因之一。