大鼠重组中枢型乙酰胆碱转移酶单克隆抗体的制备(英文)

利用分子生物学方法制备了大鼠中枢型乙酰胆碱转移酶（ｃＣｈＡＴ）的单克隆抗体并利用免疫组织化学等方法进行了检测。以大鼠纹状体ｃＤＮＡ 为模板，扩增出长度为７１５ ｂｐ 的大鼠ｃＣｈＡＴ 基因片段（含外显子６～１０）。将该片段克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ 载体中进行测序，将碱基序列正确的ｃＣｈＡＴ ｃＤＮＡ 片段定向插入ｐＭ ＡＬ－ｃ２ 载体中，构建成表达载体。利用ＤＮＡ测序对连接部位的阅读框架进行分析，未出现移码突变。将表达载体转化大肠杆菌并经诱导表达了分子量为６９ ｋＤａ 的融合蛋白，其大小与用表达载体的氨基酸序列所推导的分子量一致。用纯化后的融合蛋白作为抗原免疫Ｂａｌｂ／ｃ 小鼠，并获得了Ｍ ａｂ６７６ 克隆。利用Ｗ ｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法对其进行分析表明该克隆能识别大鼠脑组织提取物中分子量为６２ ｋＤａ 的蛋白成分，这与大鼠脑中ＣｈＡＴ 分子量的大小一致。利用此单克隆抗体进行免疫组织化学反应的阳性结构见于纹状体、苍白球、Ｂｒｏｃａ氏斜角带核、无名质、内侧隔核以及脑干的脑神经运动核等胆碱能神经元的聚集区。上述结果表明本研究所制备的单克隆抗体具有识别大鼠ｃＣｈＡＴ 的特异性。