摘要
目的构建能够表达神经生长因子-β重组腺相关病毒穿梭质粒,为进一步包装腺相关病毒奠定基础。方法利用高保真酶分别扩增pAAV-MCS的结构元件和pGenesil-1.1的功能元件,连入T-easy载体,限制性核酸内切酶酶切并回收目的片段,T4酶连接,得到含U6和CMV双启动子的重组腺相关病毒穿梭质粒pAAV-U6/CMV-EGFP;培养人MIApaca-2细胞,提取总RNA,进行RT-PCR得到人ngf-β基因,插入T-easy载体,得到T-easy-ngf-β;将ngf-β插入pAAV-U6/CMV-EGFP,构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒。结果酶切pAAV-U6/CMV-EGFP可见4250bp、800bp条带,质粒转染293细胞后可见绿色荧光蛋白表达;质粒T-easy-ngf-β酶切可见3kb、736bp条带,测序显示基因序列正确;酶切pAAV-U6/CMV-ngf-β可见4300bp、736bp条带;质粒pAAV-U6/CMV-ngf-β测序显示载体中的基因序列正确。结论成功构建ngf-β重组腺相关病毒穿梭质粒,包装表达神经生长因子的腺相关病毒,为进一步深入研究脊髓损伤的修复提供了实验基础。
出处
《中华临床医师杂志(电子版)》
CAS
2012年第7期130-131,共2页
Chinese Journal of Clinicians(Electronic Edition)
基金
国家自然科学基金项目(30772189)