还原型谷胱甘肽对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及核转录因子NF—E2相关因子2／血红素加氧酶-1信号通路的影响

Effect of reduced glutathione on proliferation of rat hepatic stellate cells and the Nrf2/HO-1 signaling pathway

目的探讨还原型谷胱甘肽（GSH）对大鼠肝星状细胞HSC—T6增殖及核转录因子NF—E2相关因子2（Nrf2）／血红素加氧酶-1（HO-1）信号通路的影响。方法分别用浓度为0、1、2、5、10mmol／L的GSH作用于经0．1μg／ml脂多糖活化的大鼠HSC-T6细胞24h后，四甲基偶氮唑盐比色法检测HSC-T6增殖情况，放射免疫法检测细胞上清液中透明质酸（HA）及Ⅳ型胶原的含量，实时荧光定量PCR检测Nrf2和HO-1的mRNA表达水平，免疫细胞化学染色法检测HSC-T6中Nrf2和HO-1的蛋白质表达情况，分光光度计检测HO-1的活性变化。两两比较采用t检验，两变量间的关系采用曲线拟合方法。结果GSH能抑制HSC—T6增殖，1、2、5、10mmol／L组的吸光度值分别为0．79±0．02、0．74±0．03、0．70±0．02、0．62±0．01，均低于0mmol／L组的0．88±0．03（t值分别为3．16、6．09、7．17、11．94，P值均〈0．05）。GSH1、2、5、10mmol／L组的HA表达量分别为（372．98±11．01）μg／L、（320．76±16．37）μg／L、（284．46±13．17）μg／L、（239．08±16．95）μg／L，明显低于0mmol／L组的（415．74±14．52）μg／L（t值分别为4．07、7．52、11．59、13．71，P值均〈0．05）；Ⅳ型胶原表达量分别为（191．27±17．49）μg／L、（163．85±16．26）μg／L、（133．03±13．14）μg／L、（103．31±12．52）μg／L，也低于0mmol／L组的（251．47±14．06）μg／L（t值分别为4．65、7．58、10．66、13．63，P值均〈0．05）。0mmol／L组HSC-T6中Nrf2 mRNA相对表达量（1．21±0．11）低于1、2、5、10mmol／L组（分别为1．51±0．06、1．92±0．08、2．69±0．07、3．43±0．07），Nrf2蛋白表达的累积吸光度值（17．84±0．61）也低于1、2、5、10mmol／L组（分别为23．85±0．20、27．90±0．32、33．69±0．75、38．64±0．38）；HO-1 mRNA相对表达量（1．25±0．09）低于1、2、5、10mmol／L组（分别为1．43±0．08、1．73±0．07、2．10±0．08、2．64±0．07），HO-1蛋白表达的累积吸光度值（16．77±0．31）也低于1、2、5、10mmol／L组（20．75±0．30、24．84±0．24、28．89±0．19、33．88±0．19），差异均有统计学意义（P值均〈0．05）。HO-1的活陛也随GSH浓度增加而上升。结论GSH可抑制HSC—T6增殖，减少其细胞外基质HA及Ⅳ型胶原分泌，其机制可能与GSH对HSC-T6的Nrf2／HO-1信号通路调控有关。

Objective To explore the effects of reduced glutathione （GSH） on the proliferation of hepatic stellate cells and the nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）/hemeoxygenase-1 （HO-1） signaling pathway. Methods The rat HSC-T6 cell line was activated by lipopolysaccharide （LPS, 0.1 μg/ml） and incubated with various concentrations of GSH （0, 1, 2, 5 and 10 mmol/L） for 24 h. Cell proliferation was evaluated by the MTT colorimetric assay. Collagen Ⅳ and hyaluronic acid （HA） contents were measured by chemiluminescence immunoassay of cell supernatants. Nrf2 and HO-1 protein expression was observed by immunohistochemistry. Nrf2 and HO-1 mRNA expression was assessed by semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction （RT-PCR）. HO-1 activity was analyzed by spectrophotometer. Results GSH treatment inhibited HSC-T6 proliferation and decreased the secretion of HA and collagen Ⅳ （P〈 0.05）; GSH treatment of HSC-T6 cells also led to increased expression of Nrf2 and HO-1, and increased activity of HO-1 （P〈0.05）. Conclusion GSH can inhibit the proliferation of hepatic stellate cells in vitro and reduce secretion of hyaluronic acid and collagen Ⅳ. The underlying mechanism in HSC-T6 cells may involve regulation of the Nrf2/HO-1 signaling pathway.