以果蝇表达载体系统构建可稳定表达抗菌性多肽Trappin-2的S2细胞株

目的采用果蝇S2表达系统,构建可与S2细胞基因组整合的分别含有Trappin-2和EGFP的重组质粒,筛选出两种抗性稳定可表达Trappin-2和EGFP的多克隆S2细胞株,为后期研究Trappin-2黏膜佐剂等生物学活性奠定基础。方法首先对pMT/Bip/V5-His A果蝇表达载体进行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信号肽,改造成为pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法从A549细胞中得到含信号肽的、完整的Trappin-2基因,在引物的5'端引入NotⅠ酶切位点及Kozak序列;引物的3'端引入XhoⅠ酶切位点和双终止密码子。利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pMT/V5-His A中,得到重组表达质粒pMT-Trappin-2(简称pMT-T2)真核表达载体。为了观察、比较转染效率和表达水平,同时构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EG-FP)的载体pMT/V5-His A-EGFP(简称pMT/EG-FP)。采用脂质体介导的转染技术将鉴定正确的两种质粒pMT-T2和pMT-EGFP分别与抗性筛选质粒pCoHygro(简称pro)共转入果蝇S2细胞中,用含有300 mg/ml潮霉素B的完全培养基进行筛选,经过3～4周,筛选出两种抗性稳定多克隆S2细胞株,用终浓度为500μmol/L的CuSO4诱导表达48 h后,分别通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2细胞中的表达水平。结果采用RT-PCR方法从A549细胞中得到Trappin-2基因,通过NotⅠ和XhoⅠ双酶切位点将Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A载体上,构建了pMT-T2和pMT-EGFP质粒,应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒pro共转染果蝇S2细胞,通过潮霉素B反复筛选,3～4周后,成功筛选到两种稳定的抗性多克隆细胞株,分别命名为S2-Trappin-2和S2-EGFP,用CuSO4分别诱导两个细胞株,在荧光显微镜下可观察到S2-EGFP主要表现为胞浆绿色荧光,RT-PCR结果证实Trappin-2在S2细胞中可稳定表达,Western blot分析S2-Trappin-2细胞培养上清可见分子量约10 ku的特异性条带,成功建立可稳定高表达Trappin-2和EGFP蛋白的果蝇S2细胞系。结论成功克隆了Trappin-2基因,并利用果蝇表达系统筛选到可分别稳定表达Trappin-2和EGFP的S2细胞株。S2-Trappin-2稳定表达细胞株的建立为进一步研究Trappin-2生物学特性、黏膜佐剂作用及在肺部感染等疾病中的应用奠定了基础。