结核分枝杆菌Rpf-DNA疫苗对Mtb感染小鼠免疫保护作用的研究

Rpf-DNA Vaccine for M. tuberculosis Infected Mice

目的评价Mtb复苏因子DNA疫苗（resuscitation-promoting factor DNA, Rpf-DNA）对Mtb感染宿主的免疫保护作用。方法构建复苏因子D（Rpf D—DNA）和复苏因子E（Rpf E-DNA）质粒疫苗，180只BALB／c小鼠（4周龄）分为6组，每组30只，分别用空质粒、Rpf D-DNA质粒、Rpf E-DNA质粒、BCG、生理盐水免疫，H37Rv标准株气溶胶感染。检测血清复苏因子（Rpf）抗体、IFN—γ；Rpf D、E刺激淋巴细胞后进行淋巴细胞增殖、细胞杀伤实验；检测细胞上清IFN-γ、IL-12、IL-2；对肺组织进行病理学检测和细菌负荷（CFU）计数。结果（1）疫苗免疫组血清RpfD、RpfE抗体水平：RpfD组0．32±0．1，RpfE组0．39±0．1，BCG组0．02±0．01，空质粒组0．01±0．0，生理盐水组0．09±0．04，空白对照组0．03±0．01，RpfD组与RpfE组抗体水平与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为RpfD：45．6，43．2，45．1，45．7；RpfE：51．6，53．6，51．0，52．2：P值均〈0．01。血清IFN-γ：RpfD组（43．9±24．8）pg／ml，RpfE组（45．9±21．0）pg／ml，BCG组（21．0±11．0）pg／ml，空质粒组（7．9±4．9）pg／ml，生理盐水组（4．7±2．1）pg／ml，空白对照组（5．8±4．7）pg/ml，RpfD、RpfE质粒组与BCG组比较差异有统计学意义（F值分别为RDfD：10．2；RpfE：12.4；P值均〈0．05），与空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有显著统计学意义，F值分别为RpfD：15．6，17．8，17．3；RpfE：17．5，21．1，20．7P值均（0．01。（2）淋巴细胞增殖实验CCK-8：RpfD组176．0±4．2，RpfE组183．0±4．3，BCG组101．0±1．1，空质粒组100．0±6．8，生理盐水组104．0±8．4，空白对照组116．0±2．2，RDfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：9．5，10．1，10．0，9．0；RpfE：11．2，12．9，11．7，10．3；P值均〈0．05。细胞杀伤实验：RpfD组32．0±3．2，RpfE组30．0±4．2，BCG组16．0±5．9，空质粒组3．3±1．5，生理盐水组6．7±0．5，空白对照组7．3±3．5，RpfD、RpfE质粒组与BCG组、空质粒组、生理盐水组、空白对照组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：8．8，14．5，13．7，11．9；RpfE：8．1，12．5，11．6，11．1；P值均〈0．05。（3）RpfD、RpfE蛋白各自刺激淋巴细胞后上清细胞因子检测：IL-2：RpfD组9．5±2．4，RpfE组9．2±1．2，BCG组2．4±2．1，空质粒组1．2±0.3，生理盐水组1．8±1．0，空白对照组1．5±0．7，RpfD、RpfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：12．5，14．6，13．5，13．9；RpfE：12．0，13．6，13．1，13．2：P值均〈0．05。IFN—γ：RpfD组22．2±5．7，RpfE组28．7±14．4，BCG组16．1±10．1，空质粒组9.8±1．6，生理盐水组13．2±2．1，空白对照组15．7±2．9，RpfD、RDfE质粒组与其他各组比较差异有统计学意义，F值分别为RpfD：7．8，12．6，8．7，8．3；RpfE：11．3，16．4，14．7，14．2；P值均〈0．05。结论实验表明复苏因子疫苗能诱导Mtb感染小鼠产生体液免疫和细胞免疫，有希望成为结核病候选疫苗之一。

Objective To evaluate the immune protective effect of resuscitation promoting factor （Rpf） DNA vaccine on M.tuberculosis （Mtb） infected mice. Method Rpf D and Rpf E plasmid DNA vaccines were construct.180 BALB/c mice with 4weeks of age were divided into 6 groups, 30 mice each group were immunized with empty plasmid, Rpf D plasmid DNA, Rpf E plasmid DNA, BCG and saline,respectively.All of mice were infected by aerosol with Mtb H37Rv. Serum anti-Rpf D or E antibodies and IFN-γ were detected. The lymphocyte proliferation assay and cytotoxicity test were performed, IFN- γ, IL-12 and IL-2 levels were tested after immunization with RpfD, EDNA vaccine. Histopathologic examination of the lung and CFU count were performed. Results （ 1 ） The antibody levels against RpfD and E were as follow：Rpf D group 0.32±0.1, Rpf E group 0.39±0.1, BCG group 0.02±0.01, empty plasmid group 0.01±0.0, saline group 0.09±0.04, blank group 0.03±0.01.The antibody levels in RpfD group and E group were significantly higher than those in BCG group, empty plasmid group, saline group, and blank group （F value：Rpf D： （45.6, 43.2, 45.1, 45.7）;RpfE： （51.6, 53.6, 51.0, 52.2）;P〈0.01）. Serum IFN-γ evels：Rpf D group （43.9±24.8） pg/ml, Rpf E group （45.9±21.0） pg/ml, BCG group （21.0±11.0） pg/ml, empty plasmid group （7.9±4.9） pg/ml, saline group （4.7±2.1） pg/ml, blank group （5.8±4.7） pg/ml, Serum IFN-γ levels of RpfD group and E group were higher than empty plasmid group, saline group, and blank group （F value：Rpf D：15.6, 17.8, 17.3 Serum IFN-γ levels of Rpf E：17.5, 21.1, 20.7, P〈0.01） . （2） The lymphocyte proliferation assay using cell counting kit-8 （CCK-8） showed：Rpf D group 176.0±4.2, Rpf E group 183.0±4.3, BCG group 101.0±1.1, empty plasmid group 100.0±6.8, saline group 104.0±8.4, blank group 116.0±2.2, which in vaccine groups were significantly higher than the other controls （F value：Rpf D：9.5, 10.1, 10.0, 9.0, Rpf E：11.2, 12.9, 11.7, 10.3, P〈0.05） . Cytotoxicity test showed：Rpf D group 32.0±3.2, Rpf E group 30.0±4.2, BCG group 16.0±5.9, empty plasmid group 3.3±1.5, saline group 6.7±0.5, blank group 7.3±3.5. The proliferation index in RpfD group and RpfE group was higher than the other control groups （F value Rpf D：8.8, 14.5, 13.7, 11.9; Rpf E：8.1, 12.5, 11.6, ll.1;P〈0.05） . （3） Cytokines in the supernatant of lymphocytes stimulated by Rpf D and Rpf E：IL-21evel：Rpf D group 9.5±-2.4, Rpf E group 9.2±1.2, BCG group 2.4±2.1, empty plasmid group 1.2±0.3, saline group 1.8 ± 1.0, blank group 1.5 ± 0.7. The IL-2 levels in RpfD group and RpfE group were higher than the other control groups （F value Rpf D： 12.5, 14.6, 13.5, 13.9 ; Rpf E：12.0, 13.6, 13.1, 13.2 ; P〈0.05） . IFN-γ level ： Rpf D group 22.2±5.7, Rpf E group 28.7± 14.4, BCG group 16.1±10.1, empty plasmid group 9.8± 1.6, saline group 13.2±2.1, blank group 15.7±2.9. The IFN-γ level in RpfD group and RpfE group were higher than the other control groups （F value Rpf D：7.8, 12.6, 8.7, 8.3; Rpf E：11.3, 16.4, 14.7, 14.2 ： P〈0.05） . Conclusion RpfD and RpfE DNA vaccines can induce immune responses including humoral and cellular immunogenicity in Mtb infected BALB/c mice. Rpf might be used as the vaccine candidate.