人凝血因子IX在毕赤酵母中的表达及活性测定

目的人凝血因子Ix（hFIX蛋白）在人类内源性凝血过程中起着非常重要的作用。hFIX表达量绝对或相对不足会导致B型血友病。本研究用毕赤酵母生产重组hFIX。方法首先用RT-PCR将人肝脏hFIX的mRNA进行扩增、测序并插入到pPIC9K中载体，构建pPIC9K—hFIX酵母分泌表达载体，再将pPIC9K—hFIX电转化进入毕赤酵母SMDl168，然后通过G418抗药性能力的大小筛选获得高拷贝且表达量高的重组菌株。结果通过SDS—PAGE和免疫印迹分析表明本研究获得的重组毕赤酵母hFIX表达量达到100mg／L；经过阴离子交换和半透膜扩散透析得到纯化的蛋白。检测重组hFIX的比活力，约为天然hFIX凝血活性的5．5％。结论我们可以优化找到更好的生产条件，使用其他比SMDll68更好的菌株，以获取更好生产量和质量；另外，我们也有很多可以增强在酵母生产的hFIX的活性。