鱼藤素抑制人胰腺癌细胞株Panc-1的增殖并诱导细胞自噬的发生

Deguelin inhibited the proliferation and induced autophage in human pancreatic cancer lines Panc-1

目的 观察鱼藤素在人胰腺癌细胞株Panc-1中的作用.方法 细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测鱼藤素对人胰腺癌细胞株Panc-1增殖的影响；碘化丙锭（PI）染色法检测鱼藤素对人胰腺癌细胞株Panc-1周期的影响；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）法检测鱼藤素对人胰腺癌细胞株Panc-1凋亡的影响；单丹（磺）酰戊二胺（MDC）和吖啶橙/溴乙啶（AO/EO）染色法检测鱼藤素对人胰腺癌细胞株Panc-1自噬的影响；Western blot技术检测鱼藤素对人胰腺癌细胞株Panc-1自噬蛋白及蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路蛋白表达的调节作用.结果 Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100、200和500 μmol/L）的鱼藤素处理24 h后,细胞存活率分别为（96.21±0.30）％、（95.40±1.78）％、（94.21 ±2.43）％、（91.27±4.24）％、（86.14±3.10）％、（80.30±3.21）％、（69.54±3.36）％；Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100、200和500μmol/L）的鱼藤素处理48h后,细胞存活率分别为（95.94±0.20）％、（93.46±1.66）％、（88.62±0.72）％、（80.16±2.64）％、（63.64±2.94）％、（49.87±3.50）％、（34.99±2.09）％；Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100、200和500 μmol/L）的鱼藤素处理72 h后,细胞存活率分别为（94.50±0.14）％、（86.98±1.26）％、（70.87±2.87）％、（51.85±6.73）％、（33.16±6.33）％、（16.29±0.83）％、（6.01±0.45）％；经不同浓度的鱼藤素处理后,Panc-1细胞的存活率明显下降,呈时间-剂量依赖性（P＜0.05）；Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100和200μmol/L）的鱼藤素处理24h后,G2/M期细胞比例分别为（13.98±2.31）％、（16.94±2.31）％、（22.61±1.79）％、（34.15±0.09）％、（43.01±1.45）％、（45.46±0.94）％；Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100和200 μmol/L）的鱼藤素处理48 h后,G2/M期细胞比例分别为（12.32±0.80）％、（14.33±0.78）％、（25.72±3.27）％、（36.91±1.50）％、（44.35 ±0.82）％、（48.94±1.63）％；不同浓度的鱼藤素作用24、48 h后,Panc-1细胞G2/M期比例明显增加（P＜0.05）.Panc-1细胞经不同浓度（0、10、25、50、100和200 μmol/L）的鱼藤素处理48 h后,对照组（0μmol/L）的凋亡率为（10.82±2.99）％,低浓度（10、25、50 μmol/L）鱼藤素处理组的凋亡率分别（11.88±2.40）％、（13.91±2.03）％、（17.28±3.67）％,与对照组比较,其促凋亡作用并不明显（P＞0.05）；高剂量（100、200 μnol/L）鱼藤素处理组的凋亡率分别为（24.80±2.92）％、（30.16±3.08）％,与对照组比较,有部分促凋亡作用（P＜0.05）.MDC和AO/EO染色结果显示Panc-1细胞内的点状阳性结构和橘红色荧光明显增加；Western blot结果显示,鱼藤素作用后自噬关键蛋白Atg5、Atg7和LC3Ⅱ表达增加,而磷酸化Akt （p-Akt）、磷酸化mTOR （p-mTOR）表达减少；使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）抑制自噬后,对照组的凋亡率为（11.26±2.89）％,3-MA和CQ处理组的凋亡率分别为（14.98±2.77）％和（18.10±3.03）％,100 μmol/L的鱼藤素引起的凋亡率为（22.37±2.45）％；分别联用3-MA和CQ后,100 μmol/L鱼藤素处理组的促凋亡率分别为（39.24±2.78）％和（55.53±3.25）％,与未加自噬抑制剂前比较,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论 鱼藤素可以明显抑制人胰腺癌细胞株Panc-1的增殖,并通过抑制Akt/mTOR信号通路和激活相关自噬蛋白的表达,进而诱导Panc-1细胞发生保护性自噬.

Objective To observe the influences and mechanisms of deguelin,a rotenoid from Mundulea sericea,on Panc-1 cell.Methods Cell counting kit-8 （CCK-8） assay detected the cell proliferation; propidium iodide （PI） staining was used to observe the change of cell cycle; Annexin V-FITC assay was performed to test apoptosis ; In order to examine the influence on autophage,monodansylcadaverine （MDC） and acridine orange/ethidium bromide （AO/EO） stain was adopted; Western blotting explored the expression of proteins include autophage and protein kinase B （Akt）/mammalian target of rapamycin （mTOR） signal.Results After the 24 hours intervention of different concentration （0,10,25,50,100,200 and 500 μmol/L） of deguelin,the survival rate of Panc-1 cell were （96.21 ± 0.30） %,（95.40 ±1.78）%,（94.21 ±2.43）%,（91.27 ±4.24）%,（86.14 ±3.10）%,（80.30 ±3.21）%,（69.54 ±3.36） % respectively; 48 hours were （95.94 ± 0.20） %,（93.46 ± 1.66） %,（88.62 ± 0.72） %,（80.16 ±2.64）%,（63.64 ±2.94）%,（49.87 ±3.50）%,（34.99 ±2.09）% respectively; 72 hours were （94.50 ±0.14）%,（86.98± 1.26）%,（70.87 ±2.87）%,（51.85 ±6.73）%,（33.16 ±6.33） %,（16.29 ± 0.83） %,（6.01 ± 0.45） % respectively.After the intervention of different concentration of deguelin,the survival rate of Panc-1 cell significantly decreased with a drug concentration-and time-dependent manner （P 〈 0.05） ; After the 24 hours intervention of different concentration （0,10,25,50,100 and 200 μmol/L） of deguelin,the rate of G2/M phase of Panc-1 cell were （13.98 ±2.31）%,（16.94±2.31）%,（22.61±1.79）%,（34.15 ±0.09）%,（43.01 ±1.45）%,（45.46±0.94）%,respectively; 48 hours were （12.32 ± 0.80） %,（14.33 ± O.78） %,（25.72 ± 3.27） %,（36.91 ±1.50）%,（44.35 ± 0.82）%,（48.94 ± 1.63）%,respectively; G2/M phase cell was obviously increased after the intervention of 24 and 48 h ; After the 48 hours intervention of different concentration （0,10,25,50,100 and 200 μmol/L） of deguelin,the apoptosis rate of Panc-1 cell were （10.82 ±2.99）%,（11.88 ±2.40）%,（13.91 ±2.03）%,（17.28 ±3.67）%,（24.80±2.92）%,（30.16±3.08） %,respectively; After the 48 hours of deguelin intervention,the low concentration （10,25 and 50 μmol/L） of deguelin did not promote Panc-1 cell apoptosis （P 〉 0.05）,the depth of deguelin（100 and 200 μmol/L） induced part of apoptosis （P 〈 0.05） ; The staining of MDC within the point-like positive structure and AO/EO within the orange-red fluorescence significantly increased ; Atg5,Atg7 and LC3 Ⅱ expression increased; p-Akt and p-mTOR＆#39; expression reduced; Use 3-methyladenine （3-MA） and CQ inhibit autophage,the apoptosis rate of control group,3-MA group and CQ group was （11.26 ± 2.89） %,（14.98 ± 2.77）%,（18.10 ± 3.03）%,respectively; Combination 3-MA and degulin （100μmol/L）gourp＇s apoptosis was （39.24 ± 2.78） % ; Combination CQ and degulin （100μmol/L） gourp＇s apoptosis was （55.53 ± 3.25） %.The apoptosis was increased rapidly when autophage was inhibited by 3-MA or CQ.Conclusion Deguelin inhibited proliferation of Panc-1 cell obviously; Deguelin induced autophage with the activation of autopahge proteins by down-regulation of Akt/mTOR signal proteins in Panc-1 cell that protected the Panc-1 cell to survival.