成年耳细胞克隆山羊(Capra hircus)

繁殖季节采集关中奶山羊卵巢,采集获得可用卵母细胞5.5枚/卵巢（1815/330）.经约20h成熟培养,第一极体排放率66.17％（1201/1815）.将有类第二极体排出结构的成熟卵母细胞去核,去核率75.44％（906/1201）.培养济宁青山羊耳部皮肤成纤维细胞传2代后液氮冷冻,解冻培养3～6代,用0.5％FBS饥饿2～10 d作为供体细胞.利用卵母细胞胞质内注射法将分离的供体细胞核胞体注入到去核卵母细胞内,注核成功率98.12％（889/906）.克隆胚胎用5 μmol/L离子酶素激活4.5 min,在含2 mmol/L 6-二甲氨基嘌呤（6 dimethylaminopurine,6-DMAP）的培养液中培养3h,然后在mCR1aaBF培养液中培养36 h,卵裂率 76.69％（645/841）.其中由未经冷藏处理供体细胞克隆得到308枚胚胎,激活后卵裂率、4-细胞发育率、囊胚发育率分别为68.5％（211/308）,59.72％（126/211）和17.46％（22/126）;另外,由4℃冷藏处理24h供体细胞获得的109枚克隆胚胎,激活率、4-细胞率、囊胚率分别为72.48％（79/109）,53.16％（42/79）和19.05％（8/42）.统计学分析表明,4℃处理供体细胞对克隆胚胎的早期发育没有显著影响.将102枚发育至4-细胞期的克隆胚胎移植到17只自然发情2～3d的受体山羊输卵管,其中非冷藏供体细胞克隆的84枚胚胎移植后没有产仔.