NADPH-d组化方法染色条件的探讨

运用定量分析方法对NADPH－d组化染色方法进行了初步探讨。实验对象采用在鼠海马，固定后的标本冰冻冠状连续切片35urn，切片染色封装后，光镜下图像分析方法定量观测染色效果。结果显示以下几个因素对染色的影响颇大。1．染液的配方：我们推荐NBT浓度为0.1mg／ml，NADPH－d浓度为1mg／ml，0．IMPBSpH7．3，Triton－100浓度为03％的配方。提高NBT浓度至0．2、04、0sing／ml，染色速度加快，但易造成深染细胞的过染而使神经元形态不清并易造成切片污染。NADPH—d的浓度最小值是ling／ml，较低的浓度05～08mg／ml染色速度减慢且着色浅淡，染色细胞数量减少。较高的浓度1．2、1．sing／ml与ling／ml的染色效果类似，但染色时间缩短。2．固定液：4％多聚甲醛固定的标本中，NADPH－d染色阳性神经元见于海马除锥体细胞层的其它各层，染色细胞为原生型NOS神经元，4％多聚甲醛＋1．25％戊H醛固定的标本可使锥体细胞显示淡阳性，似可以使内皮型NOS神经元（eNOS）显示阳性。因此，选用不同固定液有助于确定NOS的类型。3．染色时间：37C下温育以40～60分钟为宜，时间过长可造成某些胶质细胞的染色并可使染色过深。通过试验我们认为：对脑组织进行NADPH－d染色的适宜条件为：NBT浓度：0．l一0．12ms／ml。