稳定转染ABCG2 shRNA真核沉默载体的人喉癌Hep-2细胞的建立及其SP检测

目的构建ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株探讨ABCG2基因表达与Hep-2细胞中SP(侧群细胞)比例的关系。方法 (1)利用脂质体法转染ABCG2 shRNA真核沉默载体,嘌呤霉素筛选阳性转染细胞克隆,制备稳定转染shRNA真核沉默载体的Hep-2细胞系,用RT-PCR、Western-blot及免疫荧光法检测转染效率及ABCG2沉默效果。(2)Hep-2及Hep-2-shABCG2稳转细胞经Hoechest33342以及维拉帕米和PI染色后,流式细胞仪检测转染后各组细胞中SP比例的变化。结果(1)荧光显微镜检测在sh-ABCG2组和Sh-Con组的Hep-2细胞中可以清楚看到绿色荧光表达,细胞形态清晰可见;未转染组未见绿色荧光;(2)嘌呤霉素的筛选浓度:细胞培养到2周时观察到最佳筛选浓度确定为1.0 mg·L-1,维持浓度为0.5 mg·L-1;(3)RT-PCR结果显示,Hep-2细胞稳定转染shABCG2后,ABCG2表达量显著降低;而转染空载体组与未转染组ABCG2表达无明显差异;(4)Western-blot结果显示,稳转细胞Hep-2-shABCG2未检测到ABCG2蛋白表达;而空载体转染组与未转染组均可见ABCG2表达,且无明显差异(P<0.01);(5)FACS检测结果显示,与Sh-con组和未转染组相比较,shABCG2稳定转染组SP细胞比例明显降低(P<0.01)。结论 (1)成功建立ABCG2 shRNA稳定转染人喉癌Hep-2细胞株;(2)ABCG2基因表达与SP细胞比例密切相关。