单个巨噬细胞超氧阴离子水平的定量检测方法

Quantitative analysis of supperoxide anion produced by macrophages on single cell level

目的 :建立单个巨噬细胞超氧阴离子 (O 2 )水平的定量检测方法 ,从而达到在单细胞内同时检测O 2和细胞内游离钙离子浓度 ([Ca2 + ]i)的目的。方法 :分离小鼠腹腔巨噬细胞 ,用NBT还原法显示细胞产生O 2 的水平 ,以细胞加入NBT前与染色后的透光强度之比来定量表示该细胞产生O 2 的量 ;以荧光探针Fura - 2 /AM负载细胞检测单细胞内 [Ca2 + ]i。结果 :①分别用PMA、OZ刺激细胞并用NBT还原法染色后细胞内均有黑色沉淀 ,但前者分布均匀而后者所产生沉淀多偏于一侧 ,呈明显的局域性分布 ;②用NBT孵育 10min后 ,细胞透光强度没有明显变化 (n=4 3,P >0 .0 5 ) ,用NBT刺激细胞产生黑色沉淀后细胞透光强度明显降低 (P <0 .0 1,n =4 3)。③在不同的聚焦状态下 ,无细胞背景区的透光强度没有明显变化 ,而细胞区透光强度变化明显 ,但各个细胞透光强度的变化趋势是一致的 ;④PMA处理 3批巨噬细胞并用NBT法染色得到 3组ROI值的分布情况提示用ROI值定量是合理的但批间差异过大 ;⑤静息状态下的小鼠腹腔巨噬细胞 [Ca2 + ]i与细胞受PMA刺激后的ROI呈显著正相关 (n =4 3,r =0 .4 2 ,P <0 0 1)。结论 :用NBT还原法染色前后细胞透光强度比值可以代表该细胞产生O 2 的量 ,进而我们可以在单细胞内同时检测O 2 和 [Ca2 + ]i。