雌激素对增殖期ATDC5细胞生长及C型利钠肽信号通路蛋白表达的影响

Estrogen stimulates cell prolifation and rejulates the expression of proteins in C-type natriuretic peptide signaling pathway during chondrogenesis in ATDC5 cells

目的观察雌二醇（E2）对增殖期ATDC5细胞的生长及c型利钠肽（CNP）信号通路蛋白[包括CNP、利钠肽B受体（NPR-B）及利钠肽c受体（NPR·C）]表达的影响。方法以胰岛素（10μ／m1）诱导分化第6天的ATDC5细胞为研究对象，观察E2对细胞生长的影响（MTT法）及CNP、NPR-B及NPR-C蛋白表达的影响（Western-blot法）：（1）量效研究：分别加入7个不同浓度（10^-11～10^-5m0L／L）的E2（浓度组）及DMSO溶剂（对照组）共8组，比较作用24h后各组细胞数吸光度（A）值及作用48h后各组细胞的蛋白水平；（2）时效研究：加E：（10^-8moL／L）作用不同时间（0、24、48、72、96、120h）（6组），除0h外，各时间点均设相应溶剂对照组。比较不同时间点细胞数与其对照组的差值；比较0～96h细胞蛋白水平；（3）雌激素受体阻断试验：分别加入E：（10^-8moL／L）（E2组）、雌激素受体阻断剂ICI182782（10^-7moL／L）（ICI组）、E2（10^-8moL／L）和ICI182780（10^-7mol／L）（E2＋ICI组）以及溶剂DMSO（对照组），比较作用24h后4组细胞数。结果（1）量效研究：①作用24h后，与对照组（0．38±0．02）相比，随E：浓度增大，ATDC5细胞数呈增加趋势，至浓度为10。和10^-8moL／L时最为显著（4值分别为0．56±0．06和0．52±0．02，P值分别〈0．05和〈0．01）；②作用48h后，与对照组相比，各浓度组细胞CNP、NPR-B及NPR-C蛋白水平均显著增加（P均〈0．01），CNP和NPR—B蛋白增加以10^-10moL／L组最为显著，NPR-C蛋白增加以10-mol／L组最为显著。（2）时效研究：①E：（10-mol／L）分别作用24-96h后，各时间点细胞数均较对照组增多，48h时最为显著（0．030±0．003），随后逐渐减少（P〈0．05或P〈0．01），至120h时（0．007±0．001）与对照组差异无统计学意义。②CNP水平在24h时显著增加（P〈0．05），48h和72h时有增加趋势，96h时则有降低趋势。NPR-B和NPR．C蛋白水平在24h时均有增加趋势（P分别为0．060和0．055），48h则均有降低的趋势，至72h和96h时均低于对照组（P均〈0．05）。（3）雌激素受体阻断试验：作用24h时，E2组、ICI组、（E2＋ICI）组和对照组4组细胞数的差异有统计学意义（P〈0．05）。E2组（0．470±0．032）和（E2＋ICI）组（0．410±0．018）均多于对照组（0．370±0．011），E2组多于（E2＋ICI）组（P均〈0．05）；ICI组（0．360±0．035）与对照组差异无统计学意义。结论E2能通过雌激素受体介导、以时效和量效作用方式促进增殖期ATDC5细胞生长。E2在一定浓度、不同作用时间时可以不同方式调节（上调或下调）CNP、NPR-B和NPR-C蛋白的表达，提示雌激素是CNP信号通路的调节因子之一。

Objective To investigate the effect of estrogen on cell proliferation and expression of proteins of C-type natriuretic peptide （CNP）, natriuretic peptides B receptor （NPR-B） and natriuretic peptides C receptor （NPR-C） in ATDC5 cells during chondrogenesis. Method ATDC5 cells were induced for differentiation with insulin 10μ/ml （day 0）, and were started to be investigated on day 6. They were incubated with： （1） Estradiol （E2 ） at different concentrations （10^-11-10^-5 mol/L） for 24 hours （for studying cell proliferation）, or for 48 hours （ for studying CNP, NPR-B and NPR-C protein expression） ; （2） E2（10^-8 mol/L） for 24, 48, 72, 96 and 120 h （for studying cell proliferation）, or for 24, 48, 72 and 96 hours （for studying CNP, NPR-B and NPR-C protein expression） ; （3） E2 （10^-8 mol/L） , and/or ICI 182782 （estrogen receptor antagonist ） （10^_7 mol/L） for 24 hours （for studying cell proliferation）. ATDC5 cells proliferation were determined by MTT （OD value）. Western-blotting was performed to identify the protein levels of CNP, NPR-B and NPR-C. Result （ 1 ） After incubation with E2 （ 10^_11-10^-5moL/L） for 24 h, ATD5 cell number increased with the increasing E2 concentration, peak in E2 concentrations of 10^-9 and 10^-8 mol/L （0. 56 ±0. 06 and O. 52 ±0. 02, P 〈0.05 and 〈0. O1, respectively）, while significantly decreased in E2（10^-5 mol/L） （0. 30 ±0. 02） compared with DMSO-control （0. 38 ±0. 02） （P 〈0. 05）. After incubation with E2 （ 10^-11-10^-5mol/L） for 48 h, the protein level of CNP, NPR-B and NPR-C increased significantly, with the greatest effect seen at a concentration of 10^-10mol/L E2 for CNP and NPR- B, 10^-9mol/L E2 for NPR-C （P 〈0. 05）. （2）After incubation with E2（10^-8mol/L） for 24 to 96 hours①The cell number in each of the four time points was significantly increased compared with DMSO-control, with the greatest effect in 48 h （0.030 ±0.003） （P 〈0.05 or 〈0.01, respectively）. While the cell number at 120 h was similar to that in DMSO-control. ② The protein level of CNP increased significantly at 24 h （P 〈 0. 05）, seemed to be increased at 48 h and 72 h and decreased at 96 h. Both NPR-B and NPR- C level seemed to be increased at 24 h （ P = 0. 060 and 0. 055, respectively） and seemed to decrease at 48 h, with decreasing significantly at both 72 h and 96 h （P 〈 0. 05）. （3） After incubation for 24 h, there was significant difference among the cell number of the four groups （ P 〈 0. 05 ）. Cell number of group E2 （0. 470 ±0. 032） was increased compared with group （E2 ＋ ICI） （0. 410 ±0. 018 ）, both being increased compared with group DMSO-control （0. 370 ± 0.011, P 〈 0. 05, respectively）. There was no difference in cell number between group ICI 182782 （0. 360 ± O. 035 ） and group DMSO-control. Conclusion E2 promotes the proliferation of ATDC5 cells i. e. chondrogenesis via estrogen receptor mediated mechanism, in both concentration-dependent and time-dependent manner. E2 （10^-11-10^-8mol/L） up-regulates protein expression of CNP, NPR-B and NPR-C of ATDC5 cells during chondrogenesis, and regulate the expression of the three proteins mentioned above positively or negatively at different time point, which implied that estrogen is one of the regnlators of CNP signaling pathway.