游离脂肪酸和铁诱导非酒精性脂肪肝病的协同作用机制研究

Study of synergistic effect of free fatty acid and iron on the establishment of nonalcoholic fatty liver disease model

目的采用游离脂肪酸（FFA）和Fe^2＋诱导肝细胞建立非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型，探讨FFA和Fe^2＋在NAFLD发病过程中是否具有协同作用及其作用机制。方法设置对照组（细胞正常培养），0．250、0．500、1．000mmol／L油酸组，以及0．500mmol／L油酸＋0．125mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．250mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．500mmol／L Fe^2＋组，分别处理人肝癌HepG2细胞，采用油红O染色观察细胞脂质沉积，以磷酸甘油氧化酶法（GPO—PAP）测定细胞内TG的含量，采用RT—PCR法检测脂肪酸β-氧化的关键基因[脂酰CoA合成酶（ACSL-1）、肉碱棕榈酰基转移酶（CPT-1a）、脂肪酸合成酶（FAS）]的表达。分析不同组别TG含量，以及ACSL-1、CPT-1a、FAS mRNA相对值的差异。结果油红0染色结果显示，浓度为0．500mmol／L的油酸分别与不同浓度Fe^2＋共同处理HepG2细胞后，随着Fe^2＋浓度的增加，细胞内脂滴含量逐渐增多。对照组、0．250、0．500、1．000mmol／L油酸、0．500mmol／L油酸＋0．125mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．250mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．500mmol／L Fe^2＋组HepG2细胞中TG含量分别为（90．0±1．6）、（131．7±5．4）、（153．7±3．0）、（254．1±4．0）、（164．5±6．0）、（180．1±7．7）、（235．6±4．5）nmo]／mg（F=396．00，P〈0．05）。0．500mmol／L油酸、0．500mmol／L油酸＋0．125mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．250mmol／L Fe^2＋、0．500mmol／L油酸＋0．500mmol／L Fe^2＋组HepG2细胞ACSL-1mRNA的表达水平分别为0．94±0．02、0．89±0．04、0．85±0．02、0．74±0．04（F=50．00，P〈0．05），CPT-1a mRNA分别为0．89±0．03、0．79±0．05、0．67±0．04、0．51±0．05（F=79．00，P〈0．05）；FAS mRNA分别为1．31±0．05、1．44±0．03、1．51±0．05、1．56±0．06（F=79．70，P〈0．05）。结论用一定浓度的FFA和Fe^2＋培养HepG2细胞，能够诱导NAFLD模型，二者可能通过影响脂肪酸的β-氧化共同参与NAFLD的发病过程。

Objective To establish nonalcoholic fatty liver disease （NAFLD） model induced by free fatty acid （FFA） and iron, and to explore the synergistic effect of FFA and Fe^2＋ on the pathogenesis of NAFLD and mechanisms. Methods Human liver carcinoma cell HepG2 was respectively treated with 0. 250, 0. 500, 1. 000 mmol/L oleic acid, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋0. 125 mmol/L Fe^2＋ , O. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 250 mmol/L Fe^2＋ , and 0. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 500 mmol/L Fe^2＋ . Human liver carcinoma cell HepG2 was normally cultured in the control group. Lipid accumulation of cells were observed by oil red O staining and the determination of the triglyceride （TG） contents by GPO-PAP, then the expression of key genes involved in fatty acid β-oxidation （ fatty acyl CoA synthetase-1 （ ACSL-1 ） , carnitine acyl transferase 1 （CPT-1a）, fatty acid synthetase （FAS）） was determined using RT-PCR. The differences of TG content and ACSL-1, CPT-1a, FAS, mRNA relative value were analyzed among different groups. Results The results of oil red O staining indicated that the eontents of lipid droplets were obviously elevated with the increase of Fe^2＋ concentration in human liver carcinoma cell HepG2 treated with 0. 500 mmol/L oleic acid and different concentrations of Fe^2＋ . The TG contents of HepG2 cell in control group, 0. 250, 0. 500, 1. 000 mmol/L oleie acid groups, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋0. 125 mmol/L Fe^2＋ group, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 250 mmol/L Fe^2＋ group, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 500 mmol/L Fe^2＋ group respectively were （90.0±1.6）, （131.7 ±5.4）, （153.7 ±3.0） , （254. 1 24.0）, （164.5 ±6.0）, （180. 1 ±7.7）, （235.6±4.5） nmol/mg （F =396.00, P 〈0.05）. The expression levels of ACSL-1 mRNA in 0. 500 mmol/L oleic acid group, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋0. 125 mmol/L Fe^2＋ group, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 250 mmol/L Fe2 ± group, 0. 500 mmol/L oleic acid ＋ 0. 500 mmol/L Fe^2 ＋ group respectively were （ 0. 94 ± 0. 02 ）, （ 0. 89 ±0. 04 ）, （ 0. 85 ±0. 02 ）, （ 0. 74 ±0. 04 ） （ F = 50. 00, P 〈 0. 05） ; the mRNA levels of CPT-1a were （0. 89 ±0. 03）, （0. 79 ±0. 05）, （0. 67±0. 04）, （0. 51±0. 05） （F=79.00,P〈0.05）; the mRNAlevels of FAS were （1.31±0.05）,（1.44±0.03）,（1.51 ±0.05）, （ 1.56 ± 0. 06 ） （ F = 79. 70, P 〈 0. 05 ）. Conclusion The NAFLD liver cell model could be established by oleic acid and Fe^2 ＋ in HepG2 cells. FFA and iron might be involved in the pathogenesis of NAFLD through the intervention of fatty acid β-oxidation.