猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组cDNA片段的体外组装

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界范围内养猪业的猪病主要病原体。PRRSV感染导致生殖障碍、呼吸系统疾病及免疫力低下,从而诱发二次感染。为更好地控制PRRSV感染,迫切需要新的途径来制定控制措施。本试验中,作者进行了病毒基因组cDNA片段的体外Gibson组装(GA),它是一个快速、简单的恢复细胞培养过程中感染性PRRSV的方法。在恒温条件下,利用T5核酸外切酶、Phusion聚合酶和Taq连接酶的活性,GA将相互重叠的cDNA片段连接在一起。本试验将覆盖整个PRRSV基因组的4段相互重叠的cDNA片段克隆到1个载体片段中以构建能表达PRRSV基因组的质粒,将重组表达产物感染共培养的293T细胞和MARC-145细胞,感染细胞上清再在MARC-145细胞上传代来拯救感染性病毒粒子。拯救病毒的验证和特性分析证实了GA方法可生成感染性PRRSV,其特性与亲本病毒相似。然后利用这个方法检测了嵌合病毒的生成。通过GA将4个基因组片段中的1个替换成其他病毒株的相应片段,1个嵌合病毒成功被拯救。总之,本试验首次将GA作为一种简单但有效的方法在生成研究PRRSV生物学和研发新疫苗所需要的感染性PRRSV中运用。