抑制钙敏感受体表达对血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌H9c2细胞肥大的影响

Effect of suppressing calcium-sensing receptor on rat myocardial H9c2 cell hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ

目的 探讨抑制钙敏感受体（CaSR）表达对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导大鼠心肌H9c2细胞肥大的影响及作用机制.方法 采用细胞培养的方法,用AngⅡ处理H9c2细胞复制心肌肥大细胞模型,并在此基础上,应用CaSR激动剂三氯化钆（GdCl3）、CaSR抑制剂Calhex231或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理细胞.共分为5组：对照组、AngⅡ组、GdCl3＋ AngⅡ组、GdCl3＋ Calhex231＋ AngⅡ组、GdCl3＋ 3-MA＋ AngⅡ组,每组6例.采用考马斯亮蓝蛋白试剂盒测定总蛋白含量;蛋白印迹法检测心肌肥大信号蛋白Ca2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKⅡ）与其磷酸化形式（pCaMKⅡ）表达来评价细胞肥大情况;蛋白印迹法检测CaSR、自噬标志物[Beclin-1、微管相关蛋白轻链（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ、P62]和Ca2＋/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶β（CaMKKβ）-腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路的表达.结果 ①GdCl3能够促进AngⅡ所诱发的CaSR蛋白表达增多（对照组：0.22±0.04; AngⅡ组：0.43±0.02; GdCl3＋ AngⅡ组：0.63±0.08,P均＜0.05）、细胞总蛋白含量增多[对照组：（2.52±0.84）g/L;AngⅡ组：（8.72±3.60）g/L;GdCl3＋ AngⅡ组：（14.17±4.49）g/L,P均＜0.05]、pCaMKⅡ/CaMKⅡ比值升高（对照组：0.25±0.05; AngⅡ组：0.51±0.03;GdCl3＋ AngⅡ组：0.77±0.06,P均＜0.05）,而Calhex231则能够抑制GdCl3引起的上述指标的增加[GdCl3＋Calhex231＋AngⅡ组,CaSR：0.41±0.16;总蛋白含量：（9.92±2.54） g/L;pCaMK Ⅱ/CaMK Ⅱ：0.58±0.08,P均＜0.05].②GdCl3能够促进AngⅡ所诱发的自噬标志物Beclin-1蛋白表达增多（对照组：0.31±0.06; AngⅡ组：0.55±0.09;GdCl3＋AngⅡ组：0.74±0.08,P均＜0.05）、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值增加（对照组：0.28±0.06;AngⅡ组：0.56±0.10;GdCl3＋AngⅡ组：1.00±0.15,P均＜0.05）,P62蛋白表达减少（对照组：0.54±0.03;AngⅡ组：0.34±0.02; GdCl3＋ AngⅡ组：0.15±0.03,P均＜0.05）;Calhex231则能抑制GdCl3引起的自噬标志物指标的改变（GdCl3＋Calhex231＋AngⅡ组,Beclin-1：0.53±0.14;LC3Ⅱ/LC3Ⅰ：0.57±0.12;P62：0.28±0.05,P均＜ 0.05）.③GdCl3可引起pCaMKKβ/CaMKKβ（对照组：0.43±0.09;AngⅡ组：0.76±0.12;GdCl3＋ AngⅡ组：1.19±0.21）和pAMPK/AMPK（对照组：0.38±0.11;AngⅡ组：0.68±0.08;GdCl3＋ AngⅡ组：1.18±0.08,P均＜0.05）比值升高,pmTOR/mTOR（对照组：0.90±0.10;AngⅡ组：0.54±0.04;GdCl3＋AngⅡ组：0.29±0.09,P均＜ 0.05）比值降低;Calhex231则能抑制GdCl3引起的上述蛋白表达变化（GdCl3＋ Calhex231＋AngⅡ组,pCaMKKβ/CaMKKβ：0.75±0.06;pAMPK/AMPK：0.57±0.05;pmTOR/mTOR：0.51±0.08,P均＜0.05）.结论 抑制CaSR表达可逆转AngⅡ诱导的H9c2细胞肥大,其机制可能与抑制自噬、抑制CaMKKβ-AMPK-mTOR通路有关.

Objective To explore the effects and possible mechanism of calcium-sensing receptor（CaSR） in rat myocardial H9c2 cells hypertrophy model using angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）.Methods Cardiac hypertrophy model was established by treating cultured H9c2 cells with Ang Ⅱ in vitro.Hypertrophic H9c2 cells were treated with gadolinium chloride （GdCl3,a specific agonist of CaSR） and/or with Calhex231 （a specific inhibitor of CaSR） and 3-methyladenine （3-MA,a specific inhibitor of autophagy） to divided into 5 groups （six in each group）：control,Ang Ⅱ,GdCl3 ＋ Ang lⅡ,GdCl3 ＋ Calhex231 ＋ Ang Ⅱ,GdCl3 ＋ 3-MA ＋ Ang Ⅱ groups.To evaluate the status of H9c2 cells hypertrophy,protein content was determined through a coomassie brilliant blue protein kit and the expression of Ca2＋/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ （CaMK Ⅱ） and the phosphorylation form （pCaMK Ⅱ/CaMK Ⅱ） was analyzed by Western blotting.The protein expression of CaSR,autophagy maker [Beclin-1,micmtubule-associated protein 1 light chain 3（LC3）Ⅱ/LC3 Ⅰ,P62] and Ca2＋/calmodulin-dependent-protein kinase-kinase-β （CaMKKβ）-activated protein kinase （AMPK）-mammalian target of rapamycin （mTOR） pathway was analyzed by Western blotting.Results ①GdCl3 further increased H9c2 cells protein content [control group：（2.52 ± 0.84） g/L,Ang Ⅱ group：（8.72 ± 3.60） g/L GdCl3 ＋ Ang Ⅱ group：（14.17 ± 4.49） g/L,all P 〈 0.05] and the expression of CaSR （control group：0.22 ± 0.04,Ang Ⅱ group：0.43 ± 0.02,GdCl3 ＋ Ang Ⅱ group：0.63 ± 0.08,all P 〈 0.05） and pCaMK Ⅱ/CaMKⅡ （control group：0.25 ± 0.05,AngⅡ group：0.51 ± 0.03,GdCl3 ＋ AngⅡ group：0.77 ± 0.06,all P〈 0.05） induced by Ang Ⅱ.Calhex231 suppressed the increasing of hypertrophy indicators induced by GdCl3 [GdCl3 ＋ Calhex231 ＋ AngⅡ group,CaSR：0.41 ± 0.16,protein content：（9.92 ± 2.54） g/L,pCaMK Ⅱ/CaMKⅡ：0.58 ± 0.08,all P 〈 0.05].②GdCl3 promoted the effect of Ang Ⅱ in regulation of autophagy such as Beclin-1 protein increased （control group：0.31 ± 0.06,AngⅡ group：0.55 ± 0.09,GdCl3 ＋ AngⅡ group：0.74 ± 0.08,all P 〈 0.05）,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ increased （control group：0.28 ± 0.06,Ang Ⅱ group：0.56 ± 0.10,GdCl3 ＋ Ang Ⅱ group：1.00 ± 0.15,all P 〈 0.05） and P62 protein decreased （control group：0.54 ± 0.03,AngⅡ group：0.34 ± 0.02,GdCl3 ＋ AngⅡ group：0.15 ± 0.03,all P 〈 0.05）.Moreover,Calhex231 suppressed autophagy induced by GdCl3 （GdCl3 ＋ Calhex231 ＋ Ang Ⅱ group,Beclin-1：0.53 ± 0.14,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ：0.57 ± 0.12,P62：0.28 ± 0.05,all P 〈 0.05）.③GdCl3 increased pCaMKKβ/CaMKKβ （control group：0.43 ± 0.09,AngⅡ group：0.76 ± 0.12,GdCl3 ＋ AngⅡ group：1.19 ± 0.21,all P 〈 0.05）,pAMPK/AMPK （control group：0.38 ± 0.11,AngⅡ group：0.68 ± 0.08,GdCl3 ＋ AngⅡ group：1.18 ± 0.08,all P 〈 0.05） and decreased pmTOR/mTOR （control group：0.90 ± 0.10,Ang Ⅱ group：0.54 ± 0.04,GdCl3 ＋ AngⅡ group：0.29 ± 0.09,all P 〈 0.05）.Furthermore,Calhex231 blocked the effect of GdCl3 on the above-mentioned proteins changes （GdCl3 ＋ Calhex231 ＋ Ang Ⅱ group,pCaMKKβ/CaMKKβ：0.75 ± 0.06,pAMPK/AMPK：0.57 ± 0.05,pmTOR/mTOR：0.51 ± 0.08,all P 〈 0.05）.Conclusion Inhibiting calcium-sensing receptor expression has reversed H9c2 cell hypertrophy induced by Ang Ⅱ,which may be related to suppressing autophagy and suppressing CaMKKβ-AMPK-mTOR pathway.