Notch信号通路在小鼠急性肝衰竭发生发展中的作用

Role of the Notch signaling pathway in development of acute liver failure in a mouse model

目的研究Noah信号通路在急性肝衰竭发生和发展中的作用及其可能的分子机制。方法用D-氨基半乳糖腹腔注射小鼠复制急性肝衰竭模型，病理学染色观察肝组织病理学改变，Real time-PCR和Westemblot法测定肝组织Jaggedl、Notchl、Hes5mRNA与蛋白质以及NICD蛋白的表达水平，免疫组织化学染色方法检测小鼠肝组织CD68的表达情况，同时测定血清ALT、AST、白细胞介素10（IL-10）、高迁移率族蛋白B1（HMGBl）及血浆脂多糖（LPS）水平。体外培养小鼠巨噬细胞株RAW264．7细胞，用LPS和Notch信号通路特异性阻断剂DAPT进行干预，Realtime-PCR和Western Blot法检测细胞NotchlmRNA、NICD蛋白、HeS5mRNA和蛋白质的变化，同时检测细胞上清液IL-10和HMGBl水平。两组间比较用t检验，多组间数据比较用单因素方差分析，组间数据比较用口检验。相关性分析采用直线相关分析法。结果腹腔注射3．0g／kgD-氨基半乳糖36h成功复制BALB／C小鼠急性肝衰竭模型。与正常对照组相比，小鼠急性肝衰竭模型组血清ALT[（848．40±94．83）U／L比（38．99土9．63）U／L]、AST【（911．49±67．65）U／L比（55．28±7．50）U／L]、HMGBl[（101．91±12．43）μg／L比（20．73±5．37）μg／L]、IL-10[（4627．88±842．45）pg／ml比（1064．92±238．46）pg／ml]、血浆LPS【（11．80±0．89）EU／ml比（0．58±0．12）EU／m1]、肝组织Jaggedl（mRNA：7．63±1．41比1．00±0．00，蛋白质：0．71±0．07比0．34±0．07）、Notchl（mRNA：7．10±0．66比1．00±0．00，蛋白质：0．66±0．11比0．27±0．08）、NICD（蛋白质：0．76±0．08比0．27±0．08）、HeS5（mRNA：7．95±0．71比1．00土0．00，蛋白质：1．20±0．07比0．76±0．07）、CD68（7685．05±417．34比2294．01±392．93）水平均明显升高，差异均有统计学意义（t值分别为34．78、50．98、26．68、16．74、47．91、23．04、17．05、35．56、13．25、21．52、38．84和15．73，P值均〈0．01）。LPS可显著提高RAW264．7细胞上清液HMGBl【（7．44±0．63）μg／L比（0．21±0．05）±g／L]、IL-10[（315．19±79．13）Pg／ml比（59．19±23．30）μg／ml]、细胞Notchl（mRNA：6．49±0．73比1．00±0．00）、NICD（蛋白质：0．65±0．10比0．23±0．07）、Hes5（mRNA：7．30±0．85比1．00±0．00，蛋白质：0．96±0．10比0．54±0．07）水平（口值分别为41．53、13．93、30．18、17．41、31．94和15．20，P值均〈0．01），加入DAPT后上述指标水平显著下降（分别为6．22±0．71、252．06±57．63、3．20±0．68、0．42±0．05、4．72±0．67和0．84±0．09，g值分别为7．03、3．44、18．07、9．27、13．08和4．36，P值均〈0．05）。结论LPS可以通过激活肝脏巨噬细胞内Notch信号通路，促进HMGBl、IL-10的分泌，尤以升高HMGBl水平为主，参与急性肝衰竭的发生和发展。

Objective To investigate the role of the Notch signaling pathway, and the underlying mechanism, in development of acute liver failure （ALF） in a mouse model. Methods For in vivo analysis of the role of Notch signaling in ALF, a mouse model of ALF was generated by intraperitoneal injection of 3.0 g/kg D-galactosamine. Histological specimens were stained by hematoxylin-eosin, and then studied microscopically. Expression level of Jaggedl, Notchl, NICD, and Hes5 was measured by western blotting （for protein） and real time-PCR （for mRNA）. The level of CD68 protein was detected by immunohistochemical staining. Serum levels of alanine aminotransferase （ALT）, aspartate aminotransferase （AST）, IL-10, high mobility group box 1 （HMGB1） chromatin protein, and lipopolysaccharide （LPS） were measured by standard methods. For in vitro analysis of the molecular mechanism, the RAW264.7 macrophage cell line was cultured with LPS in the absence or presence of the Notch inhibitor DAPT, and the intracellular levels of Notchl, N1CD, and Hes5 were measured by western blotting and real time-PCR and the extracellular levels of IL-10 and HMGB1 were detected in the supernatant. Results Compared with unmodeled （normal control） mice, the ALF modeled mice showed higher levels of serum ALT （848.40±94.83 U/L vs. 38.99±9.63 U/L）, AST （911.49±67.65 U/L vs. 55.28±7.50 U/L）, HMGB1 （101.91±12.43 μg/L vs. 20.73±5.37 μg/L）, IL-10 （4 627.88±842.45 pg/mL vs. 1 064.92±238.46 pg/mL） and LPS （11.80±0.89 EU/mL vs. 0.58±0.12 EU/mL）, as well as higher expression of Jaggedl （mRNA： 7.63±1.41 vs. 1.00±0.00; protein： 0.71±0.07 vs. 0.34±0.07）, Notchl （mRNA： 7.10±66 vs. 1.00±00; protein： 0.66±0.11 vs. 0.27±0.08）, NICD （protein： 0.76±0.08 vs. 0.27±0.08）, Hes5 （mRNA： 7.95±0.71 vs. 1.00±0.00; protein： 1.20±0.07 vs. 0.76±0.07）, and CD68 （protein： 7 685.05±417.34 vs. 2 294.01±392.93） （all P 〈 0.01）. In vitro, LPS increased the extracellular levels of HMGB 1 （7.44±0.63 vs. 0.21 ±0.05）, IL- 10 （315.19±79.13 vs. 59.19±23.30） and the intracellular expression ofNotchl （mRNA： 6.49±0.73 vs. 1.00±0.00）, NICD （protein： 0.65±0.10 vs. 0.23±0.07）, and Hes5 （mRNA： 7.30±0.85 vs. 1.00±0.00; protein： 0.96±0.10 vs. 0.54±0.07） （all P 〈 0.01）. DAPT treatment led to a decrease above the index serum levels of HMGB1 （6.22.4.0.71） and IL- 10 （252.06±57.63）, and of expression of Notchl （mRNA： 3.20±0.68）, NICD （protein： 0.42±0.05）, and Hes5 （mRNA： 4.72±0.67; protein： 0.84±0.09） （P 〈 0.01 or 〈 0.05）. Conclusion The Notch signaling pathway may plan an important role in the development of ALF upon activation of the pathway in macrophages by LPS and leading to promoted secretion of HMGB1 and IL-10, with a greater effect on the former.