用cre-loxp鼠研究Runx2在釉质发育中的作用

目的为研究Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响,拟建立Runx2基因条件性敲除的小鼠动物模型。方法利用染色体位点特异性重组酶cre-loxp系统和FLP-frt的条件性基因打靶,借助于同源重组将两个同向的loxp位点置于Runx2基因的编码重要功能域外显子2两侧的内含子序列中,从而获得表型正常的Flox小鼠,为了提高ES细胞筛选的效率,插入被FRT位点瞄定的、作为选择性筛选的阳性标记neo基因,同时插入作为负性筛选的DTA,通过电转的方式,将构建成功的载体电导入到ES细胞,并通过对中靶的ES细胞进行筛选和鉴定,得到了同源重组正确的阳性克隆,通过显微注射,将中靶的ES细胞导入囊胚中,将囊胚移植到代孕鼠子宫内,最终得到嵌合体小鼠,将此嵌合体小鼠与FLP工具鼠杂交,利用FRT与FLP特异性识别,去掉neo基因即可获得阳性的loxp鼠,将其与组织特异性表达cre重组酶的转基因小鼠杂交,特异性表达的cre重组酶将介导loxp位点间的基因片段重组。小鼠出生后经PCR鉴别,获得Runx2基因条件性敲除的杂合子小鼠,条件性敲除的杂合子小鼠自交或与loxp纯合子小鼠杂交,小鼠出生后,PCR鉴别筛选条件性完全敲除的小鼠。RT-PCR法检测外源性Cre基因的表达。结果构建了cre鼠、loxp鼠和Runx2基因条件性敲除的小鼠模型。结论利用染色体位点特异性重组酶loxp-cre系统和FLP-frt系统可以很好的研究Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响。