同步检测7种鱼类病毒的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立和应用

Amplicon Rescue Multiplex PCR(Arm-PCR): a Novel Tool for Simultaneous Detection of Seven Types of Fish Viruses

淋巴囊肿病毒(LCDV)、肿大细胞病毒属虹彩病毒(Mega)、赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)、传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)、病毒性出血败血症病毒(VHSV)和传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)是养殖鱼类主要的病毒性病原,危害巨大。为实现这7种病原的高通量、同步检测,本研究在分析这7种病毒基因序列的基础上,设计了9组扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)引物,并对扩增体系中的Taq酶、M^g(2+)、d NTP、Primer Mix浓度及退火温度等参数进行调整和优化,结合基因芯片检测技术,建立了同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR体系为:Taq酶(2.5 U/μl)1.0μl,10×PCR Buffer(含20 mmol/L的M^g(2+))5μl,d NTP(各2.5 mmol/L)5μl,10×Primer Mix(各2μmol/L)9μl,模板1μl,dd H2O补足至50μl,退火温度为56℃。研究结果显示,该方法可以在1支反应管内对上述7种病毒的9个致病基因同步进行扩增和检测,检测灵敏度分别为10~1copies/μl(RGNNV、VHSV、ISAV-NS、ISAV-MA)、10~2 copies/μl(LCDV、Mega、IHNV、IPNV)和10~3 copies/μl(大菱鲆红体病虹彩病毒,TRBIV)。该方法特异性强,与半滑舌鳎、石斑鱼、大菱鲆和牙鲆基因组DNA不产生交叉反应。本研究建立的可同步检测7种鱼类病毒的Arm-PCR方法具有高通量、高灵敏度、高准确性的优势,能有效提高工作效率,在鱼类病毒的筛查和流行病学调查领域有广泛的应用前景。

Major fish viruses that are severely harmful in aquaculture industry include Lymphocystis disease virus （LCDV）,Megalocytivirus （Mega）, red-spotted grouper nervous necrosis virus （RGNNV）, infectious haematopoietic necrosis virus （IHNV）, infectious pancreatic necrosis virus （IPNV）, viral hemorrhagic septicemia virus （VHSV） and infectious salmon anaemia virus （ISAV）. Here we developed a specific amplicon rescue multiplex PCR （Arm-PCR） combined with gene microarray technique for the simultaneous detection of the seven types of fish viruses. First we optimized the conditions of Arm-PCR such as the annealing temperature and the concentrations ofTaq DNA polymerase, Mg^2＋, dNTP and Primer Mix shown as follows. Reaction mixture （50μl） consisted of 1.0μlTaq DNA polymerase （2.5 U/μl）, 5μl 10×PCR Buffer （20 mmol/L Mg^2＋）, 5μl dNTP （2.5 mmol/L each）, 9μl 10×Primer Mix （2μmol/L）, and 1μl template. The annealing temperature was 56℃. This method could simultaneously produce specific amplicons in one tube. The detection sensitivity of the Arm-PCR was 101 copies/μl for RGNNV, VHSV,non-structural protein of ISAV （ISAV-NS）, andmatrix protein of ISAV（ISAV-MA）, 10^2 copies/μl for LCDV, Mega, IHNV, and IPNV, and 10^3 copies/μl for TRBIV （Turbot reddish body iridovirus）. The Arm-PCR did not cause cross reactions with genomic DNA from healthy fish such as half smooth tongue sole, grouper, turbot and flounder.