TrkA过表达及抑制表达慢病毒载体转染对BMSCs存活的影响

目的探讨NGF及其特异性受体——原肌球蛋白相关激酶A（TrkA）能否有效调控骨髓基质干细胞（BMSCs）的成活。方法2015年5月至2015年11月，利用慢病毒载体感染SD大鼠BMSCs构建过表达TrkA的Over-TrkA BMSCs及其对照Vector BMSCs，TrkA表达抑制的shRNA-TrkA BMSCs及其对照BMSCs，以及未感染的正常BMSCs，共5组。利用MTT法、血清剥夺实验和Tunel染色检测在添加和不添加NGF的情况下各组BMSCs在体外培养1~8 d内的增殖及存活情况。利用单因素方差分析和t检验进行统计学分析。结果慢病毒感染后传代培养3代，BMSCs的形态和表型并没有发生明显变化。蛋白印迹法检测显示Over-TrkA BMSCs表达TrkA的水平显著上调；而TrkA-shRNA BMSCs在经神经诱导14 d后，TrkA的表达亦明显受到抑制。MTT法检测显示，Over-TrkA BMSCs在培养第5天后增殖速率出现下降；而TrkA-shRNA BMSCs在培养第3天后增殖速率显著增加，差异有统计学意义（P 〈 0.05）。经血清剥夺处理4 d后，Tunel染色结果显示，未添加NGF时，Vector BMSCs和Control BMSCs组细胞凋亡率分别为（28.6 ± 2.0）%和（46.6 ± 5.1）%；在添加NGF时凋亡率分别减少至（9.3 ± 2.8）%和（8.3 ± 1.5）%，差异有统计学意义（P 〈 0.01）。Over-TrkA BMSCs在未添加NGF时其凋亡率即明显降低为（0.8 ± 0.6）%，添加NGF时为（0.6 ± 0.1）%，组间差异有统计学意义（P 〈 0.01）。相反地，TrkA-shRNA BMSCs在未添加NGF时凋亡率为（10.9 ± 0.8）%，而在添加NGF时TrkA-shRNA BMSCs的凋亡率却显著增加至（44.9 ± 5.2）%，差异有统计学意义（P 〈 0.01）。结论过表达TrkA以及NGF/TrkA通路的激活能促进BMSCs在体外的成活并有效对抗由血清剥夺诱导的细胞凋亡。但TrkA表达下调使NGF促细胞成活向NGF促细胞凋亡方向转变。因而，NGF/TrkA能有效调控BMSCs的成活，该机制的阐明可能有效促进BMSCs作为种子细胞在移植治疗周围神经缺损方面的应用。