人EC-SOD基因真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建携带EC-SOD基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体,并观察其在人脐带间充质干细胞(hu MSCs)细胞中的表达。方法:从人外周血中提取总RNA,逆转率制备c DNA,采用聚合酶链式反应(PCR)中获取EC-SOD基因,其与真核表达载体p CS2+经Cla I/Eco RI双酶切后;经T4 DNA连接酶连接,获得重组质粒p CS2+-EC-SOD,用菌液PCR、Cla I/Eco RI双酶切及测序鉴定正确后,将其与经PCR获取的EGFP基因用Eco RI/xba I双酶切;经T4 DNA连接酶连接,获得p CS2+-EC-SOD-EGFP重组质粒,用菌落PCR、Eco RI/xba I双酶切及测序鉴定。用纳米试剂法转染hu MSCs细胞,用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达。结果:成功获取了EC-SOD基因和EGFP基因,重组质粒p CS2+-ECSOD-EGFP经菌落PCR和双酶切均得到大小一致的目的条带,经测序鉴定该序列与Gen Bank中人EC-SOD基因、EGFP基因序列的同源性达100%,基因插入方向正确;重组质粒转染hu MSCs细胞后可见EGFP增强绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了EC-SOD的真核表达重组质粒p CS2+-EC-SOD-EGFP,且能在hu MSCs细胞中表达。