高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备方法

研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体（Mabs）的制备方法。本研究以HP—PRRSV为研究对象，参照已发表的PRRSV基因组序列，设计一对PCR引物，并在其上下游分别添加BamHI和salI酶切位点，获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接，转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆，经酶切鉴定和测序验证后，转化至E．coli BL21（DE3）中，经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后，取细菌菌体用SDS-PAGE分析。结果表明，Nsp2在大肠杆菌中得到表达。经包涵体的提取，用猪抗PRRSV血清抗体进行Western—bolt鉴定，结果表明，融合表达的pET28a—dNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别。取纯化的pET28a—Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化，并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6—8周龄BALB／c小鼠。取其脾细胞与SP2／0的骨髓瘤细胞融合，经间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选，采用有限稀释法进行克隆。经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV—Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2F1。Western—blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应，而不与PRRSVCHIA株发生反应，证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb。抗体亚类鉴定结果表明，重链为IgG1型，轻链为x链。采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1：800，腹水效价分别为1：12800。这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段。