miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其机制

Effect of miR - 20a on pulmonary surfactant synthesis of alveolar epithelial cells A549 and its mechanism

目的研究miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其可能的作用机制。方法将成功构建的miR-20a过表达慢病毒载体（miR-20a组）与空载慢病毒（空载组）分别转染A549细胞，通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达确定转染效率；采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况；生物信息学方法预测miR-20a促进肺发育的潜在相关靶基因；实时荧光定量PCR（qPCR）检测miR-20a、肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）、肺表面活性物质相关蛋白B（SP-B）、肺表面活性物质相关蛋白C（SP-C）和肺表面活性物质相关蛋白D（SP-D）mRNA的表达；免疫印迹法检测SP-A、SP-B、SP-C、SP-D及信号转导及转录活化因子3（STAT3）蛋白水平。结果通过绿色荧光表达观察到慢病毒成功转染入A549细胞，RT-PCR提示转染miR-20a过表达慢病毒载体后miR-20a的表达（3．85±0．18）较正常组（0．99±0．04）及空载组（1．21±0．12）显著增高，差异均有统计学意义（t=10．85、9．64，均P〈0．001），细胞株成功建立。与正常组（24h、48h、72h：0．23±0．01、0．39±0．01、0．56±0．03）及空载组（24h、48h、72h：0．25±0．01、0．44±0．05、0．59±0．01）比较，miR-20a对不同时间的A549细胞增殖（24h、48h、72h：0．26±0．01、0．41±0．02、0．58±0．02）无影响，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。在线软件预测发现STAT3基因很可能是miR-20a的靶基因。与正常组（1．00±0．05、1．24±0．20、1．31±0．09、0．89±0．12）及空载组（0．76±0．10、1．31±0．13、1．50±0．11、1．01±0．11）比较，miR-20a可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP．DmRNA的表达（2．05±0．17、2．14±0．10、2．84±0．09、1．66±0．08），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。与正常组（0．46±0．01、0．27±0．03、0．69±0．01、0．43±0．01）及空载组（0．43±0．01、0．21±0．01、0．79±0．02、0．44±0．02）比较，miR-20a也可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP-D蛋白的表达（0．55±0．01、0．47±0．05、0．96±0．02、0．59±0．03），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。。与正常组（0．60±0．04）及空载组（0．68±0．06）比较，miR-20a组STAT3表达水平（0．37±0．05）显著降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论STAT3是miR-20a的靶基因，miR-20a很可能通过抑制STAT3表达来促进A549细胞合成肺表面活性物质。

Objective To explore the role of miR -20a on pulmonary surfactant synthesis of alveolar epithelial cells A549 and its potential mechanism. Methods Lentivirns miR -20a overexpression vector（ miR -20a group） or lentivirus no - load vector （ no - load group ） was transfected into A549 cells, and the expression of green fluorescent protein（GFP） was observed to determinate the transfection efficiency;cell proliferation was detected by using 3 - （4, 5 - Dimethyhhiazol - 2 - yl ） - 2,5 - diphenyltetrazolium bromide （ MTT ） ; the bioinformatics software and database were applied to predict and analyze the target genes of miR - 20a about lung development ; expressions of miR - 20a, pulmonary surfactant- associated protein A（ SP- A） , pulmonary surfactant- associated protein B （SP- B ） , pulmonary surfactant -associated protein C （SP -C ） and pulmonary surfactant -associated protein D （SP- D） mRNA were detec- ted by using quantitative real -time PCR（qPCR） ;the expressions of SP - A protein, SP - B protein, SP - C protein, SP - D protein and protein signal transducers and activators of transcription 3 （ STAT3 ） were detected by using Western blot. Results Observation of GFP expression under a fluorescent microscope indicated similar transfection efficiency, and real time - PCR showed that the expression of miR - 20a increased after being transfected with lentivirus miR - 20a overexpression vector（3.85 ±0.18） compared with the normal group（0.99 ±0.04） and the no - load group（ 1.21 ± 0. 12） ,and the differences were significant（t = 10.85,9.64,all P 〈0. 001 ）. As a resuh,lentivirus miR -20a overex- pression vector was constructed successfully. Online software predicted that STAT3 gene was likely to be the target gone of miR -20a. Compared with the normal group （24 h ,48 h ,72 h ：0.23 ± 0.01,0.39 ± 0.01,0.56 ± 0.03 ）and the no -load group （24 h,48 h,72 h ：0.25 ± 0.01,0.44 ± 0.05,0.59 ± 0.01 ）, miR - 20a did not change the cell proliferation at different time points （ 24 h,48 h,72 h ：0.26 ± 0.01,0.41 ± 0.02,0.58 ± 0.02 ） （ all P 〉 0.05 ）. Compared with the normal group （1.00±0.05,1.24 ±0.20,1.31 ±0.09,0.89 ±0.12） and the no -load group （0.76±0.10,1.31 ± 0.13,1.50 ± 0. 11,1.01 ± 0.11 ）, miR - 20a up - regulated the mRNA expressions of SP - A, SP - B, SP - C and SP - D （ 2.05 ± 0. 17,2.14 ± 0.10,2.84 ± 0.09,1.66 ± 0.08 ）, and the differences were significant （ all P 〈 0.05 ）. Compared with the normal group （0.46 ± 0.01, 0.27 ± 0.03, 0.69 ± 0.01, 0.43 ± 0.01 ） and no - load group （0.43 ± 0.01, 0.21 ± 0.01,0.79 ± 0.02, 0.44 ± 0.02 ） , miR - 20a also increased the protein expressions of SP - A, SP -B, SP-C and SP-D （0.55 ±0.01, 0.47 ±0.05, 0.96 ±0.02, 0.59 ±0.03） ,the diffe-rences were statisti- cally significant （all P 〈 0.05 ）. The expression of STAT3 in miR -20a group （0.37 ± 0.05 ） was significantly lower than that in the normal group（0.60±0.04） and the no -load group （0.68±0.06） ,and the differences were statistically sig- nificant （ all P 〈 0.05 ） in A549. Conclusions STAT3 is a downstream target gene of miR - 20a. miR - 20a can promote pulmonary surfactant synthesis of alveolar epithelial cells A549 by inhibiting STAT3.