蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白在人星形胶质细胞中穿膜能力和保护作用的研究

Protein transduction domain4-Cu, Zn superoxide dismutase fusion protein reduces hypoxic apoptosis in human astrocyte cultures

目的观察蛋白质转导4型-铜锌超氧物歧化酶融合蛋白（protein transduetion domain4-Cu,Zn superoxidedismutase fusion protein, PTD4-Cu,Zn-SOD）能否穿膜进入人星形胶质细胞、能否减轻人星形胶质细胞的缺氧损伤。方法①Westem blot：从干预时间（15、30、60min）和干预浓度（0．5、1．0、2．0μmol／L）两个方面观察融合蛋白能否穿膜。②实验分组：制备细胞缺氧损伤模型，按完全随机法分为对照组、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）组（SOD组）和PTD442u，Zn-SOD组（PTD4-SOD组），对照组加DMEM（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）培养基（不含血清），其余两组分别加入含有Cu，Zn-SOD和PTD4-Cu，Zn-SOD终浓度为2μmol／L的DMEM培养基，三组干预时间均为1h，用AnnexinV／PI凋亡试剂盒流式测凋亡，观察融合蛋白能否减轻细胞缺氧损伤。结果①对照组各组未发现明显的蛋白条带，SOD组各个干预时间点（15、30、60min）与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；PTD4-SOD组在15、30min两个时间点与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；在干预60min时与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。②对照组各组未发现明显的蛋白条带，SOD组的各个剂量（0．5、1．0、2．0μmol／L）与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；PTD4-SOD组在0．5、1．0μmol／L两个浓度与对照组比较，差异无统计学意义（P〉0．05）；在浓度为2μmol／L时与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。③对照组的凋亡率为（27．03±0．50）％，SOD组凋亡率为（23．29±0．58）％，和对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；而PTD4-SOD组凋亡率为（12．06±0．19）％，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；PTD4-SOD组和SOD组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论①PTD4-Cu，Zn-SOD能进入体外培养的人星形胶质细胞内；细胞内融合蛋白的量随着培养的时间和加入融合蛋白浓度的增加而增加。②融合蛋白PTD4-Cu，Zn-SOD能减轻人星形胶质细胞缺氧损伤后的凋亡。

Objective To test whether protein transduction domain4-Cu, Zn superoxide dismutase fusion protein （PTD4-Cu, Zn-SOD） can penetrate into human astrocytes and whether it can mitigate hypoxic damages in human astrocytes. Methods ① Western blot was employed to analyze penetration of superoxide dismutase （SOD） and PTD4-Cu, Zn-SOD into human astrocytes. ② The human astrocyte cultures were subjected to hypoxia, then were respectively treated with dulbecco＇s modified eagle＇s medium （DMEM） （Control）, SOD （2 μ mol/L） and PTD4-Cu,Zn-SOD（PTD4-SOD, 2μ mol/L）. Flow cytometry was performed to analyze apoptosis in human astroeytes labeled with Annexin V/PI apoptosis Kits. Results ① PTD4-SOD, but not SOD, penetrated into human astrocyte euhures after 60 rain incubation. ② Although 0.5-2.0 μmol/L SOD did not penetrate into human astrocytes, 2.0 μmol/L （not 0.5 mol/L and 1.0 μmol/L） PTD4-SOD did. ③ Hypoxia-induced apoptosis in （27.03 ±0.50）% of astrocytes. SOD and PTD4-SOD significantly reduced apoptotic cells to （23.29±0.58）% and （12.06±0.19）% of total cells, respectively. Conclusions PTD4-Cu,Zn- SOD can penetrate the membrane of human astrocytes and reduce hypoxia-induced apoptosis,depending on the incubation time and dosage.